光合細(xì)菌（球形紅假單胞菌）發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q-,10-的研究.pdf

1、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10是最有潛力實現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn)方法，輔酶Q10的醫(yī)療價值和保健功能不斷得到應(yīng)用，光合細(xì)菌富含輔酶Q10，因此本論文以球形紅假單胞菌（R.sphaeroides)1.1737T為出發(fā)菌株，通過紫外和化學(xué)復(fù)合誘變，先篩選出抗羅紅霉素突變株，然后以該突變株為出發(fā)菌株，篩選得到耐對羥基苯甲酸的突變株P(guān)HBr-2，其輔酶Q10產(chǎn)量可達(dá)50.60mg/L。突變株P(guān)HBr-2連續(xù)傳代5次后，其輔酶Q10的產(chǎn)量為49.5mg/L，

2、比原始菌株R.sphaeroides R1(16.37mg/L)提高了202.38％。證明經(jīng)紫外誘變和亞硝基胍復(fù)合誘變獲得的突變株P(guān)HBr-2的性狀能穩(wěn)定遺傳。 采用紫外分光光度法測定輔酶Q10含量，確定以堿皂化法提取輔酶Q10，并對堿皂化法進行優(yōu)化，得到了堿皂化法的工藝為：菌懸液離心并洗滌菌體，在濕菌體中加入5mL丙酮，冰浴條件下超聲波破碎并移入圓底燒瓶中，加入pH3.0的酸性水10mL，攪拌均勻，90℃下回流1h，緩慢加入1

3、0％NaOH15mL，混勻，90℃回流1h，迅速冷卻，加入25mL，正己烷提取2次，合并萃取液，去離子水洗至中性，以無水硫酸鈉脫水至澄清，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再用10mL無水乙醇溶解，即得輔酶Q10的抽提液。 研究Mg2+、Fe2+、Mn2+的不同濃度對輔酶Q10產(chǎn)量的影響，表明其對輔酶Q10的生產(chǎn)起促進作用。通過正交實驗法確定了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：無水乙酸鈉1，檸檬酸鈉2，蛋白胨3，酵母膏3，硫酸銨7，磷酸二氫鉀3，硫

4、酸鎂1，氯化鈉2，碳酸氫鈉1，加入微量元素溶液、維生素溶液各1mL。最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH值6.5、溫度30℃、光強3000Lx、接種量4％。經(jīng)過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，菌株P(guān)HBr-2的輔酶Q10產(chǎn)量可達(dá)74.4mg/L，比優(yōu)化前(49.5mg/L)提高了50.30％。 用硅膠柱層析法對輔酶Q10粗提液進行分離純化。比較了不同孔徑分布的200-300目與80-120目粗孔Ⅱ號硅膠的分離效果，確定采用80-120目粗孔Ⅱ

5、號硅膠為固定相，以正己烷/無水乙醇(V/V=8:2)為流動相洗脫，經(jīng)過無水乙醇結(jié)晶純化，輔酶Q10粗提液的提純率為77.08％。 通過對該菌不同培養(yǎng)模式的初步探索，將接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基在30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h后，將其放置在光照強度為3000Lx的培養(yǎng)箱里靜置培養(yǎng)，比接種后直接光照靜置培養(yǎng)，其輔酶Q10產(chǎn)量由74.4mg/L提高到78.36mg/L，通過觀察溶氧、pH值在發(fā)酵過程中的變化，得出溶氧是輔酶Q10發(fā)酵中