BoC-D-CMK經(jīng)鼻給藥對(duì)全腦缺血大鼠功能損害和神經(jīng)損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　1.利用大鼠四動(dòng)脈阻斷全腦缺血模型，探索在全腦缺血再灌注后經(jīng)鼻給予天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑Ⅳ（caspase-1 InhibitorⅣ，Boc-D-CMK; caspase-1抑制劑的一種）是否能減輕全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥。
　　2.利用大鼠四動(dòng)脈阻斷全腦缺血模型，探索在全腦缺血再灌注后經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK是否能減輕全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的凋亡及神經(jīng)元損傷。
　　3.利用大鼠四動(dòng)脈阻斷全腦

2、缺血模型，探索在全腦缺血再灌注后經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK是否對(duì)全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的功能損害有保護(hù)作用。
　　4.利用大鼠四動(dòng)脈阻斷全腦缺血模型，探討caspase-1參與保護(hù)全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.清潔級(jí)健康SD大鼠6只，雄性，應(yīng)用生物素標(biāo)記的caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥12小時(shí)后處死大鼠，利用共聚焦顯微鏡顯像觀察生物素標(biāo)記的caspase-1抑制劑在腦內(nèi)的分布情況。

3、>　　2.清潔級(jí)健康SD大鼠12只，雄性，在大鼠四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型中，采用分光光度比色法檢測(cè)缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)caspase-1的活性。
　　3.清潔級(jí)健康SD大鼠48只，雄性，隨機(jī)分為三組:假手術(shù)對(duì)照組;缺血組;缺血+Boc-D-CMK組（治療組）。采用大鼠四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型，應(yīng)用免疫印跡、免疫組化研究蛋白表達(dá)量的變化，采用分光光度計(jì)比色法檢測(cè)酶的活性，采用ELISA的方法檢測(cè)炎癥因子的分泌，利用免疫熒光和激光共聚焦

4、技術(shù)觀察蛋白的表達(dá)、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元存活和線粒體的膜電勢(shì)，采用焦油紫染色和TUNEL染色研究海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞存活和凋亡，應(yīng)用巴恩斯迷宮和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)判斷大鼠的學(xué)習(xí)記憶、記憶缺失等神經(jīng)功能損害。
　　結(jié)果:
　　1、成年雄性SD大鼠海馬CA1區(qū)caspase-1蛋白的表達(dá)
　　首先，我們觀察了在不進(jìn)行缺血的假手術(shù)大鼠海馬CA1區(qū)caspase-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。采用免疫熒光染色法檢測(cè)caspase-1、微管相關(guān)

5、蛋白(Microtubule associatedprotein-2，MAP2)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)顯示了caspase-1在大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)，且結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-1在海馬CA1區(qū)與MAP2和GFAP共染，提示caspase-1在在大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在全腦缺血再灌注后第三天和第十四天，caspase-1在海馬CA1區(qū)星

6、形膠質(zhì)細(xì)胞存在明顯的過表達(dá)。
　　2、生物素標(biāo)記的caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥后在中樞神經(jīng)的分布
　　應(yīng)用生物素標(biāo)記的caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥12小時(shí)后處死大鼠，取腦片常規(guī)處理后加入二抗，利用共聚焦顯微鏡顯像觀察了生物素標(biāo)記的caspase-1抑制劑在腦內(nèi)的分布，結(jié)果提示caspase-1抑制劑經(jīng)鼻給藥后可以滲入大鼠腦內(nèi)，且證實(shí)藥物可以分布在缺血敏感的海馬CA1區(qū)，caspase-1抑制劑主要分布在海馬和皮層神經(jīng)

7、元的細(xì)胞漿內(nèi)。
　　3、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)caspase-1的過表達(dá)和caspase-1的活性
　　首先該研究測(cè)定了大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)caspase-1活性的時(shí)間曲線。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與缺血前相比，在大鼠全腦缺血再灌注后所有時(shí)間點(diǎn)caspase-1活性均增加，大鼠全腦缺血再灌注后第3天前后達(dá)到高峰，第5天仍維持在較高水平。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)

8、經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK可明顯抑制大鼠全腦缺血再灌注后第3天海馬CA1區(qū)活化的caspase-1，且這種活化的caspase-1多在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
　　4、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以改善全腦缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體功能
　　經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能逆轉(zhuǎn)全腦缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，M

9、MP)變化，能明顯增加線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性，免疫印跡法結(jié)果分析進(jìn)一步表明，Boc-D-CMK能減少全腦缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞漿的釋放，從而增加細(xì)胞色素C在線粒體的含量，可能減輕全腦缺血對(duì)神經(jīng)元線粒體功能的損害。
　　5、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)活化的caspase-9和活化的caspase-3的激活
　　共聚焦結(jié)果顯

10、示，在大鼠全腦缺血再灌注第3天，活化的caspase-9和活化的caspase-3的活性顯著增加。通過雙重免疫熒光染色研究表明，活化的caspase-9和活化的caspase-3與神經(jīng)元特異性核蛋白(Peuronal-specific nuclear protein，NeuN)陽性細(xì)胞共染，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能明顯減少共染的活化的caspase-9及活化的caspase-3的激活。
　　6、經(jīng)鼻給予caspase-

11、1抑制劑Boc-D-CMK后處理可以抑制全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)的凋亡
　　免疫熒光染色顯示，在全腦缺血再灌注后第3天，全腦缺血再灌注誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)細(xì)胞層TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP1)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能顯著減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和PARP1陽性細(xì)胞數(shù)的增加。
　　7、經(jīng)鼻給予caspase-1

12、抑制劑Boc-D-CMK后處理能減少全腦缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化
　　首先，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，在全腦缺血再灌注后第3天，海馬CA1區(qū)離子鈣接頭蛋白抗體（Ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba1）和GFAP含量與假手術(shù)對(duì)照組相比明顯增加，表明在全腦缺血再灌注早期階段即誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞增生，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理

13、可明顯降低Iba1和GFAP的增加。共聚焦顯微鏡結(jié)果提示，在全腦缺血再灌注后第14天，缺血再灌注誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活或活化。
　　8、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理可抑制海馬CA1區(qū)全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和減少神經(jīng)元死亡
　　在全腦缺血再灌注后第3天，海馬CA1區(qū)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-

14、6和TNF-α分泌顯著增加，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理明顯抑制了海馬CA1區(qū)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。通過焦油紫染色、NeuN染色共聚焦顯微鏡顯像進(jìn)行的組織學(xué)評(píng)價(jià)，證實(shí)全腦缺血再灌注可誘導(dǎo)缺血易損的海馬CA1區(qū)局部神經(jīng)元死亡，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理顯著增加全腦缺血再灌注后第14天海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量。
　　9、經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK后處理能改善大鼠全腦缺血再灌注誘導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙

15、，能顯著增強(qiáng)缺血后大鼠的新物體識(shí)別的長程記憶能力。
　　應(yīng)用巴恩斯迷宮評(píng)估大鼠海馬依賴的空間學(xué)習(xí)和記憶能力發(fā)現(xiàn)，全腦缺血再灌注后大鼠定位到目標(biāo)逃離暗箱的時(shí)間明顯延長，并且在探索階段測(cè)試中，在目標(biāo)逃離暗箱所在四分之一象限停留的時(shí)間縮短，而經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能改善大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。由于海馬的完整性還與如新物體識(shí)別記憶能力的非空間的學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)，本研究應(yīng)用新物體識(shí)別試驗(yàn)評(píng)估各組大鼠，發(fā)現(xiàn)全腦缺血再灌注后的大鼠對(duì)新

16、物體的識(shí)別指數(shù)降低，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK后處理能改善大鼠新物體識(shí)別能力的下降。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)鼻給予的Boc-D-CMK能進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，隨后發(fā)揮抑制caspase-1的活性，降低神經(jīng)元線粒體的功能損害，抑制缺血易損的海馬CA1區(qū)活化的caspase-3、活化的caspase-9和凋亡，能增加神經(jīng)元的存活數(shù)量。
　　2.經(jīng)鼻給予的Boc-D-CMK改善大鼠全腦缺血導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙、長程識(shí)別能力下降。<

17、br>　　3.進(jìn)一步的研究表明，經(jīng)鼻給予Boc-D-CMK發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制如下:抑制過度膠質(zhì)活化、抑制下游促炎因子減輕神經(jīng)炎癥的反應(yīng)、顯著增加海馬CA1區(qū)NeuN-陽性細(xì)胞數(shù)而減少TUNEL-陽性細(xì)胞數(shù)和PARP1-陽性細(xì)胞數(shù)。
　　總之，本研究表明，經(jīng)鼻給予caspase-1抑制劑Boc-D-CMK能通過調(diào)節(jié)抗炎和抗凋亡的作用以減少大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞死亡，使其功能損害得以改善。該研究提示，抑制casp