Smad7在Sox9協(xié)同BMP2軟骨化中的作用研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein2）隸屬于BMPs家族，可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells）成軟骨分化。因此被認(rèn)為是構(gòu)建基因強(qiáng)化的組織工程軟骨的重要因子。聯(lián)合運(yùn)用Sox9可在增強(qiáng)BMP2誘導(dǎo)軟骨化的同時抑制BMP2所介導(dǎo)的成骨分化，從而優(yōu)化了成軟骨效應(yīng)，但其作用靶點(diǎn)仍不明確。而 BMP2誘導(dǎo)下上調(diào)的Smad7作為成軟骨負(fù)性因子被發(fā)現(xiàn)在軟骨內(nèi)成骨中起到重要作用，可能是So

2、x9作用的潛在靶點(diǎn)。本研究主要探討Sox9與Smad7在BMP2誘導(dǎo)的軟骨分化與軟骨終末成熟骨化的關(guān)系，為組織工程軟骨的構(gòu)建與穩(wěn)定提供新思路新靶點(diǎn)。
　　方法：
　?。?）用 HEK293細(xì)胞擴(kuò)增已經(jīng)構(gòu)建完成的腺病毒 Ad-BMP2、Ad-Smad7和Ad-Sox9后轉(zhuǎn)染入小鼠骨髓MSCs C3H10T1/2，到達(dá)目標(biāo)時間后Western-blot檢測目的基因蛋白表達(dá)情況；
　?。?）平面培養(yǎng)情況下按照測定滴度將AdB

3、MP2，AdBMP2+AdSox9轉(zhuǎn)染C3H10T1/2，AdGFP轉(zhuǎn)染組作對照，以微球培養(yǎng)的方式模擬三維狀態(tài)一直到14天，提取RNA逆轉(zhuǎn)錄后，QPCR檢測各處理組不同時間點(diǎn) Smad7、OPN與 MMP13；提取各種總的蛋白測定濃度后采用Western-blot技術(shù)檢測各情況之下Smad7的蛋白水平；
　?。?）平面培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞用AdBMP2和/或AdSox9感染，以AdGFP感染組作對照，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各處理

4、組細(xì)胞基質(zhì)Smad7表達(dá)情況；
　?。?）通過裸鼠皮下注射高濃度的感染目的病毒的C3H10T1/2的方式構(gòu)建成軟骨成骨在體模型。將獲得的骨塊進(jìn)行形態(tài)與組織觀察，以了解Smad7在不同的水平下對BMP2介導(dǎo)的軟骨化與軟骨內(nèi)成骨的作用。
　?。?）感染離體的胎鼠肢芽，感染目標(biāo)病毒，了解Smad7在不同水平下對軟骨分化形成與軟骨成熟骨化中的作用
　?。?）通過對不同水平Smad7的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，證實(shí)不同水平Smad7

5、對BMP2誘導(dǎo)凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）各重組腺病毒均可以有效轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)相關(guān)蛋白。
　?。?）在體外的微球培養(yǎng)中，BMP2可上調(diào)Smad7表達(dá)水平，而外源性高表達(dá)Sox9能抑制BMP2誘導(dǎo)的Smad7水平上調(diào)，Smad7相關(guān)因子OPN與MMP13基因表達(dá)水平也可被Sox9抑制。
　?。?）在免疫組化實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Sox9可抑制由BMP2所上調(diào)的Smad7表達(dá)，使其維持低表

6、達(dá)狀態(tài)。
　　（4）裸鼠皮下種植成骨實(shí)驗結(jié)果證實(shí)高表達(dá)Sox9組在抑制Smad7表達(dá)情況下促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)的軟骨形成，抑制BMP2介導(dǎo)的軟骨內(nèi)化骨，而高表達(dá)Smad7組軟骨與成骨均形成受抑。
　?。?）胎鼠前肢器官培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Sox9抑制BMP2誘導(dǎo)的Smad7可促進(jìn)肢芽軟骨細(xì)胞的增殖分化而抑制肢芽軟骨細(xì)胞肥大，而高表達(dá)Smad7抑制增殖區(qū)域加大肥大區(qū)域。
　?。?）高表達(dá)Sox9組可降低BMP2誘導(dǎo)的凋亡，而高表達(dá)Sma