Smad4與Smad7在胃癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景:胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,居全球腫瘤發(fā)病和癌癥死亡率的第二位,在我國(guó)其死亡率位居惡性腫瘤之首,胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素進(jìn)行性發(fā)展過(guò)程,正常情況下,胃粘膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡保持著動(dòng)態(tài)平衡,而這種平衡的維持有賴(lài)于癌基因、抑癌基因及眾多細(xì)胞因子的共同調(diào)控。近年來(lái),細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)己成為普遍關(guān)注的生物學(xué)問(wèn)題,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)著多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及死亡等生物學(xué)行為,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),由Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

2、生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是其中一個(gè)重點(diǎn)。 Smad蛋白質(zhì)群是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,直接參與TGF-β超家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),為目前所知的細(xì)胞內(nèi)唯一的TGF-β受體激酶的底物,能將TGF-β信號(hào)由胞膜轉(zhuǎn)入核內(nèi),Smad經(jīng)磷酸化后可轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β后信號(hào),其作用包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡,TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路是由TGF-β超家族、TGF-β受體、Smad蛋白家族及其核內(nèi)

3、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組成的腫瘤抑制通路,通路中任一元件異常都可引起TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)紊亂,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Smad4是目前在哺乳動(dòng)物中被確認(rèn)的唯一共同通道型Smad,在TGF-β超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)節(jié)事件中起中樞作用。Smad7屬于抑制型Smad(Ⅰ-Smad),目前,僅知道Smad7的功能是抑制受體激活的Smad蛋白介導(dǎo)的TGF-β和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),有人把它列為癌基因之列。 目前已經(jīng)證實(shí):Smad4在胰腺癌細(xì)胞中失活,其表

4、達(dá)缺失與胰腺癌發(fā)展、組織細(xì)胞分級(jí)有關(guān),Smad4表達(dá)與胃癌組織的分化程度明顯相關(guān),分化越低,表達(dá)越少,臨床預(yù)后較差。Smad4在肝癌組織表達(dá)低于同一病理標(biāo)本的癌旁組織,Smad4在結(jié)腸癌中功能性缺失率為30%,在體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)Smad4質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組細(xì)胞增高,G0+G1期細(xì)胞百分比增高而S期細(xì)胞降低,細(xì)胞凋亡比例增加。Smad7蛋白在肝癌組織明顯高于同一病理標(biāo)本的癌旁組織。Smad7在胃癌發(fā)生、發(fā)展

5、中的表達(dá)如何;體外轉(zhuǎn)染Smad4及Smad7質(zhì)粒后對(duì)胃癌細(xì)胞有何影響,國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道,本課題應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù),檢測(cè)Smad4及Smad7在不同胃組織中的表達(dá),應(yīng)用Westem-blotting、流式細(xì)胞儀及MTT法研究體外轉(zhuǎn)染Smad4及Smad7質(zhì)粒后對(duì)胃癌細(xì)胞的影響,以探討其對(duì)與胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。 目的:研究Smad4及Smad7在不同胃組織中的表達(dá)及作用。 方法:病理學(xué)證實(shí)的胃癌根治性切除的胃癌組織標(biāo)

6、本78例,胃癌旁組織78例,采用SP免疫組織化學(xué)染色技術(shù),檢測(cè)Smad4及Smad7在不同胃組織中的表達(dá)。 結(jié)果: 1.Smad4蛋白在胃癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為69.23%,在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為44.87%,二者比較X2=9.44,p<0.01;低分化胃癌Smad4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為26.32%,較高、中分化胃癌Smad4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率62.50%明顯減少,差別有顯著性(P<0.01);而高、中分化胃癌的Sma

7、d4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率(62.50%)與胃癌旁組織(69.23%)相比差別則無(wú)顯著性(P>0.1);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性表達(dá)率為23.25%,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為71.43%,差別亦有顯著性(X2=18.10,P<0.01),38例低分化胃癌中有5例Smad4蛋白表達(dá)完全缺失,有1例呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。 2.Smad7蛋白在胃癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為17.95%,大部分為弱陽(yáng)性表達(dá),僅2例為陽(yáng)性表達(dá),在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為89.74%

8、,二者比較x2=80.89,p<0.01;低分化胃癌Smad7蛋白的表達(dá)(97.37%)較高、中分化胃癌(82.50%)明顯,差別有顯著性(P<0.05);高、中分化胃癌(82.50%)與胃癌旁組織(17.95%)相比差別有顯著性(P<0.01);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性表達(dá)率為97.67%,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性表達(dá)率80.00%,Smad7蛋白表達(dá)亦有差別顯著性(x2=6.55,P<0.05),在低分化胃癌中以陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主,而高、中分化胃

9、癌Smad7蛋白的表達(dá)則以弱陽(yáng)性及陽(yáng)性表達(dá)為主。 結(jié)論: 1.Smad4蛋白在胃癌組織中低表達(dá),與癌旁組織比較差異顯著(P<0.01),其表達(dá)的陽(yáng)性率與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 2.Smad7蛋白在胃癌組織中高表達(dá),與癌旁組織比較差異顯著(P<0.01),其表達(dá)的陽(yáng)性率與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 目的:體外轉(zhuǎn)染Smad4及Smad7質(zhì)粒后對(duì)胃癌細(xì)胞的影響,以探討其對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。 方

10、法:以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901胃癌細(xì)胞株為研究對(duì)象,將脂質(zhì)體與Smad4及Smad7復(fù)合物1μg、4μg、8μg分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h,通過(guò)Western-blotting鑒定目的基因表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況,應(yīng)用MTT法計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率,以觀察Smad4和Smad7對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果: 1.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體Smad4,Smad7的SGC7901細(xì)胞中分別出現(xiàn)了Smad4,S

11、mad7基因表達(dá)的蛋白條帶,證實(shí)Smad4,Smad7基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。 2.質(zhì)粒載體Smad4 1μg、4μg、8μg轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h,1μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為:10.2%、15.6%、21.7%;4μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為:16.8%、21.8%、28.9%;8μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為:22.3%、31.7%

12、、43.6%,隨著濃度與時(shí)間的增加,胃癌細(xì)胞凋亡率增加,以8μg72h最高。 3.質(zhì)粒載體Smad7 1μg、4μg、8μg轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h,1μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為:29.7%、26.5%、16.2%;4μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為: 24.8%、22.3%、14.8%;8μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為:21.6%、1

13、9.4%、13.3%,隨著濃度與時(shí)間的增加,胃癌細(xì)胞凋亡率反而降低,以8μg72h的胃癌細(xì)胞凋亡率最低。 4.MTT法計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率,以觀察Smad4和Smad7不同濃度及時(shí)間對(duì)胃癌細(xì)胞的影響,Smad4的濃度為1μg、4μg、8μg時(shí),細(xì)胞相對(duì)存活率分別為67.69%、54.80%、32.61%。Smad7的濃度為1μg、4μg、8μg時(shí),細(xì)胞相對(duì)存活率分別為53.59%、61.48%、67.71%。 結(jié)論:

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