Smad4與Smad7在胃癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，居全球腫瘤發(fā)病和癌癥死亡率的第二位，在我國其死亡率位居惡性腫瘤之首，胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多因素進(jìn)行性發(fā)展過程，正常情況下，胃粘膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡保持著動態(tài)平衡，而這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及眾多細(xì)胞因子的共同調(diào)控。近年來，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)己成為普遍關(guān)注的生物學(xué)問題，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)著多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、分裂及死亡等生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，由Smad介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

2、生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是其中一個重點。 Smad蛋白質(zhì)群是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，直接參與TGF-β超家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為目前所知的細(xì)胞內(nèi)唯一的TGF-β受體激酶的底物，能將TGF-β信號由胞膜轉(zhuǎn)入核內(nèi)，Smad經(jīng)磷酸化后可轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β后信號，其作用包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡，TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)通路是由TGF-β超家族、TGF-β受體、Smad蛋白家族及其核內(nèi)

3、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組成的腫瘤抑制通路，通路中任一元件異常都可引起TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)紊亂，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Smad4是目前在哺乳動物中被確認(rèn)的唯一共同通道型Smad，在TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)節(jié)事件中起中樞作用。Smad7屬于抑制型Smad(Ⅰ-Smad)，目前，僅知道Smad7的功能是抑制受體激活的Smad蛋白介導(dǎo)的TGF-β和BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，有人把它列為癌基因之列。 目前已經(jīng)證實：Smad4在胰腺癌細(xì)胞中失活，其表

4、達(dá)缺失與胰腺癌發(fā)展、組織細(xì)胞分級有關(guān)，Smad4表達(dá)與胃癌組織的分化程度明顯相關(guān)，分化越低，表達(dá)越少，臨床預(yù)后較差。Smad4在肝癌組織表達(dá)低于同一病理標(biāo)本的癌旁組織，Smad4在結(jié)腸癌中功能性缺失率為30％，在體外對結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)Smad4質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比對照組細(xì)胞增高，G0+G1期細(xì)胞百分比增高而S期細(xì)胞降低，細(xì)胞凋亡比例增加。Smad7蛋白在肝癌組織明顯高于同一病理標(biāo)本的癌旁組織。Smad7在胃癌發(fā)生、發(fā)展

5、中的表達(dá)如何；體外轉(zhuǎn)染Smad4及Smad7質(zhì)粒后對胃癌細(xì)胞有何影響，國內(nèi)外鮮有報道，本課題應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測Smad4及Smad7在不同胃組織中的表達(dá)，應(yīng)用Westem-blotting、流式細(xì)胞儀及MTT法研究體外轉(zhuǎn)染Smad4及Smad7質(zhì)粒后對胃癌細(xì)胞的影響，以探討其對與胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。 目的：研究Smad4及Smad7在不同胃組織中的表達(dá)及作用。 方法：病理學(xué)證實的胃癌根治性切除的胃癌組織標(biāo)

6、本78例，胃癌旁組織78例，采用SP免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測Smad4及Smad7在不同胃組織中的表達(dá)。 結(jié)果： 1.Smad4蛋白在胃癌旁組織中的陽性表達(dá)率為69.23％，在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為44.87％，二者比較X2=9.44，p<0.01；低分化胃癌Smad4蛋白的陽性表達(dá)率為26.32％，較高、中分化胃癌Smad4蛋白的陽性表達(dá)率62.50％明顯減少，差別有顯著性(P<0.01)；而高、中分化胃癌的Sma

7、d4蛋白的陽性表達(dá)率(62.50％)與胃癌旁組織(69.23％)相比差別則無顯著性(P>0.1)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達(dá)率為23.25％，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的蛋白陽性表達(dá)率為71.43％，差別亦有顯著性(X2=18.10，P<0.01)，38例低分化胃癌中有5例Smad4蛋白表達(dá)完全缺失，有1例呈強(qiáng)陽性表達(dá)。 2.Smad7蛋白在胃癌旁組織中的陽性表達(dá)率為17.95％，大部分為弱陽性表達(dá)，僅2例為陽性表達(dá)，在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為89.74％

8、，二者比較x2=80.89，p<0.01；低分化胃癌Smad7蛋白的表達(dá)(97.37％)較高、中分化胃癌(82.50％)明顯，差別有顯著性(P<0.05)；高、中分化胃癌(82.50％)與胃癌旁組織(17.95％)相比差別有顯著性(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達(dá)率為97.67％，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性表達(dá)率80.00％，Smad7蛋白表達(dá)亦有差別顯著性(x2=6.55，P<0.05)，在低分化胃癌中以陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)為主，而高、中分化胃

9、癌Smad7蛋白的表達(dá)則以弱陽性及陽性表達(dá)為主。 結(jié)論： 1.Smad4蛋白在胃癌組織中低表達(dá)，與癌旁組織比較差異顯著(P<0.01)，其表達(dá)的陽性率與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 2.Smad7蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，與癌旁組織比較差異顯著(P<0.01)，其表達(dá)的陽性率與胃癌的分化程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 目的：體外轉(zhuǎn)染Smad4及Smad7質(zhì)粒后對胃癌細(xì)胞的影響，以探討其對胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。 方

10、法：以對數(shù)生長期的SGC7901胃癌細(xì)胞株為研究對象，將脂質(zhì)體與Smad4及Smad7復(fù)合物1μg、4μg、8μg分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h，通過Western-blotting鑒定目的基因表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，應(yīng)用MTT法計算細(xì)胞相對存活率，以觀察Smad4和Smad7對胃癌細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體Smad4，Smad7的SGC7901細(xì)胞中分別出現(xiàn)了Smad4，S

11、mad7基因表達(dá)的蛋白條帶，證實Smad4，Smad7基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。 2.質(zhì)粒載體Smad4 1μg、4μg、8μg轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h，1μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為：10.2％、15.6％、21.7％；4μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為：16.8％、21.8％、28.9％；8μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為：22.3％、31.7％

12、、43.6％，隨著濃度與時間的增加，胃癌細(xì)胞凋亡率增加，以8μg72h最高。 3.質(zhì)粒載體Smad7 1μg、4μg、8μg轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h，1μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為：29.7％、26.5％、16.2％；4μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為： 24.8％、22.3％、14.8％；8μg 24h、48h及72h后的胃癌細(xì)胞凋亡率分別為：21.6％、1

13、9.4％、13.3％，隨著濃度與時間的增加，胃癌細(xì)胞凋亡率反而降低，以8μg72h的胃癌細(xì)胞凋亡率最低。 4.MTT法計算細(xì)胞相對存活率，以觀察Smad4和Smad7不同濃度及時間對胃癌細(xì)胞的影響，Smad4的濃度為1μg、4μg、8μg時，細(xì)胞相對存活率分別為67.69％、54.80％、32.61％。Smad7的濃度為1μg、4μg、8μg時，細(xì)胞相對存活率分別為53.59％、61.48％、67.71％。 結(jié)論：