云斑天牛纖維素酶Ⅱ轉(zhuǎn)基因家蠶的制作及其相關(guān)特性研究.pdf

1、飼料效益一直是家蠶育種家所關(guān)注的經(jīng)濟(jì)性狀。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究認(rèn)為二十世紀(jì)八十年代推廣的蠶品種與前期推廣的品種相比，雖然繭絲成績(jī)有了顯著提高，但蠶的消化率以及飼料效率沒(méi)有變化;目前，我國(guó)生產(chǎn)上推廣的蠶品種的飼料效率仍沒(méi)有提高。
　　 桑葉是家蠶的主要飼料來(lái)源，家蠶從桑葉中攝取維持身體機(jī)能和成長(zhǎng)所必需的各種營(yíng)養(yǎng)成分。桑葉干物質(zhì)由蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等組成，其中，大部分蛋白質(zhì)、脂質(zhì)可以被蠶體吸收利用;由于蠶體中腸沒(méi)有降解纖維素的相應(yīng)的酶，作

2、為桑葉細(xì)胞壁主要成分的纖維素的吸收率只有0.04％，不能被蠶兒吸收利用，是影響桑葉消化吸收的主要因素。
　　 轉(zhuǎn)基因技術(shù)可使外源基因在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中整合、表達(dá)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以打破自然條件下的種系隔離，使基因能在種系遙遠(yuǎn)的機(jī)體間流動(dòng)。本研究首先從云斑天牛中腸組織中克隆到昆蟲(chóng)內(nèi)源性纖維素酶Ⅱ基因（β-1，4-endoglucanaseⅡfromthebeetle，Batocerahorsfieldi，Bh-EGaseⅡ），在

3、家蠶BmN細(xì)胞及家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)了重組酶Bh-EGaseⅡ，并對(duì)該酶的活性進(jìn)行分析，構(gòu)建了可分泌Bh-EGaseⅡ基因的轉(zhuǎn)基因載體，初步探討了Bh-GaseⅡ基因?qū)倚Q幼蟲(chóng)的糖代謝及繭質(zhì)成績(jī)的影響。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.云斑天牛內(nèi)源性纖維素酶Ⅱ的cDNA克隆、表達(dá)和酶活性分析
　　 利用RACE方法從云斑天牛（Batocerahorsfieldi）中腸組織中克隆出一個(gè)新的纖維素酶基因，即為Bh-EGaseⅡ。該基

4、因結(jié)構(gòu)是由一個(gè)外顯子組成，沒(méi)有內(nèi)含子。Bh-EGaseⅡ?qū)儆谔擒账饷讣易?5(Glycosylhydrolasefamilies45，GHF45)，在其氨基酸序列的第36-48位置有1個(gè)GHF45非常保守的催化位點(diǎn)，并且具有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。
　　 Bh-EgaselⅡ蛋白質(zhì)的氨基酸序列中只有一個(gè)單一的催化結(jié)構(gòu)域，不存在纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和間隔序列，這與來(lái)源于桑天牛(Aprionagermari)的Ag-EgaseⅠ、Ag-E

5、gaseⅡ以及白蟻后腸中的纖維素酶的氨基酸序列相類似。Bh-EGaseⅡ與Ag-EGaseⅡ的相似性達(dá)93.72％;與Ag-EGaseⅠ的相似性達(dá)73.64％;與三化螟甲蟲(chóng)（O.albomarginatachamela）的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的相似性達(dá)67.78％。
　　 通過(guò)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在BmN細(xì)胞和家蠶5齡幼蟲(chóng)中表達(dá)出Bh-EgaseⅡ。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)和Westernblot分析，結(jié)果顯

6、示:細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)約為28kDa，而細(xì)胞上清液和家蠶幼蟲(chóng)血淋巴中的蛋白質(zhì)約為33kDa。這可能是因?yàn)樵摶蛴?個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)，56-58(N-K-S)、99-101(N-S-T)、237-239(N-Y-S)，并有14個(gè)保守的半胱氨酸(C)殘基，分泌到細(xì)胞外的蛋白經(jīng)翻譯后折疊、糖基化修飾后蛋白質(zhì)分子量增大。
　　 Bh-EagseⅡ與Ag-EgaseⅡ的相似度達(dá)93.72％，而Ag-EgaseⅡ的99-101(

7、NST)的N糖基化位點(diǎn)是該酶是否有活性的關(guān)鍵，這也是已知甲蟲(chóng)GHF45的纖維素酶的共性。用剛果紅染色法檢驗(yàn)了重組Bh-EgaseⅡ的酶活性，結(jié)果是細(xì)胞裂解液中的重組Bh-EgaseⅡ酶沒(méi)有活性;與之相反，細(xì)胞上清液及幼蟲(chóng)血淋巴中的重組酶具有活性，這可能是因?yàn)楹笳呓?jīng)翻譯后糖基化修飾及折疊所致。
　　 在BmN細(xì)胞上清液、幼蟲(chóng)血液中表達(dá)的Bh-EGaseⅡ的酶活力大約是928U/mg，重組酶最佳pH值與最佳溫度分別為pH6.0和50

8、℃，在pH8.0-9.0、20-30℃時(shí)的酶活性能維持在60％左右，符合家蠶中腸的酸堿環(huán)境和家蠶飼養(yǎng)的適宜溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步了解Bh-EgaseⅡ的基因結(jié)構(gòu)和昆蟲(chóng)纖維素酶的酶學(xué)活性;該基因是一個(gè)轉(zhuǎn)基因提高桑蠶纖維素利用效率的合適基因。
　　 2.轉(zhuǎn)Bh-EGaseⅡ基因載體的構(gòu)建及在BmN細(xì)胞中的檢驗(yàn)
　　 構(gòu)建基于piggyBac的Bh-EGaseⅡ的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到家蠶BmN細(xì)胞中

9、，利用熒光檢測(cè)方法證明重組質(zhì)粒中的報(bào)告基因eGFP獲得表達(dá);剛果紅染色法檢驗(yàn)了Bh-EGaseⅡ酶的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步使轉(zhuǎn)基因載體中的Bh-EGaseⅡ在家蠶幼蟲(chóng)中的成功表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.利用外源Bh-EGaseⅡ基因提高家蠶纖維素利用率的研究初探
　　 按照標(biāo)準(zhǔn)方法顯微注射家蠶大造品種的早期胚胎，篩選獲得了攜帶有綠色熒光標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體，建立單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因品系。利用基因組PCR、反向PCR技術(shù)手段

10、對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體的插入位點(diǎn)進(jìn)行了分子水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因品系的大造基因組中插入了外源基因，插入位點(diǎn)位于第4號(hào)染色體上。
　　 用DNS比色法測(cè)定轉(zhuǎn)基因家蠶腸腔中食物還原糖的OD540nm值，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因蠶還原糖的平均OD540值為0.429，均方差為0.0024;對(duì)照蠶還原糖的平均OD540值為0.381，均方差為0.0021，達(dá)顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果說(shuō)明整合到家蠶基因組中的外源Bh-EGaseⅡ基因已在轉(zhuǎn)基因個(gè)

11、體中表達(dá)并分泌到腸腔中;分泌到腸腔中的Bh-EGaseⅡ酶將腸腔食物中的纖維素降解，致使食物中的還原糖含量升高。
　　 家蠶6-磷酸果糖激酶-1(Bombyxmoriphosphofructokinase，BmPFK)是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵酶。利用realtimeRT-PCR方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因蠶的BmPFKmRNA的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因家蠶中腸的BmPFK的mRNA的表達(dá)量是對(duì)照區(qū)的1.58倍，并達(dá)到顯著差異(P＜0.05)，說(shuō)

12、明導(dǎo)入Bh-GaseⅡ基因后，不但使腸腔中的還原糖含量增高，而且使中腸細(xì)胞中的糖酵解循環(huán)加快。
　　 糖酵解與蛋白質(zhì)代謝的關(guān)系緊密，糖酵解的中間產(chǎn)物可用于合成各種氨基酸的碳架結(jié)構(gòu)，經(jīng)轉(zhuǎn)氨后可生成各種氨基酸;糖分解過(guò)程產(chǎn)生的能量可用于氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。對(duì)轉(zhuǎn)Bh-GaseⅡ基因蠶的繭質(zhì)成績(jī)進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因蠶雌雄平均全繭量、繭層量為1.073g、0.134g，分別比對(duì)照提高3.5％、3.1％。推測(cè):纖維素是促進(jìn)食物在中腸