外源性NGF對CGRP轉基因MSCs治療骨質(zhì)疏松大鼠中CGRP表達的影響.pdf

1、研究目的：
　　1.評價外源性NGF聯(lián)合CGRP轉基因骨髓干細胞移植治療骨質(zhì)疏松大鼠療效;
　　2.探究外源性NGF對轉CGRP的基因的干細胞移植治療中，CGRP mRNA及蛋白表達水平的影響。
　　研究方法：
　　1.骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的體外分離、純化、及培養(yǎng)。
　　選取6只4周齡雌性SD大鼠，獲取雙下肢長骨骨骨髓組織標本，進行體外分離、純化、傳代培養(yǎng)，獲得適量的骨髓MSCs細胞。
　　

2、2.構建CGRP基因表達載體。
　　以實驗同源SD大鼠基因組為模板，PCR擴增CGRP基因的編碼序列，進行pBaBb-puro-CGRP真核表達載體構建。
　　3.轉染MSCs及制備穩(wěn)定的轉基因CGRP-MSCs細胞系。
　　將已構建pBaBb-puro真核表達載體，用293FT（人胚腎）細胞系增殖后，反轉錄(Retrovirus)轉染至骨髓間充質(zhì)干細胞中，待細胞增值融合時，病毒進行感染，進一步篩選，獲得穩(wěn)定CGRP轉

3、基因骨髓間充質(zhì)干細胞系(CGRP-BMSCs)，擴增、培養(yǎng)。
　　4.建立骨質(zhì)疏松大鼠實驗動物模型。
　　使用維甲酸混懸液連續(xù)灌胃實驗SD大鼠，日劑量70mg/kg/1次，連續(xù)4周（分籠飼養(yǎng)，每籠4只，在相對濕度為50％-80％，室溫22-26°條件下的清潔級環(huán)境中，全部予以標準自由攝食、飲水飼養(yǎng)），獲取骨質(zhì)疏松SD大鼠實驗動物模型。
　　5.實驗動物干預處理。
　　實驗干預:A組，空白對照組，無菌生理鹽水PBS

4、處理;B組，單純骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療（以對照組同等計量的MSCs移植治療處理）;C組，轉基因降鈣素基因相關肽骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療組（CGRP-MSCs移植治療處理）;D組，外源性神經(jīng)生長因子聯(lián)合轉基因降鈣素基因相關肽骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療組（同等計量的CGRP-MSCs+NGF移植治療處理）。
　　6.實驗標本收集、數(shù)據(jù)處理分析。
　　分別在上訴實驗干預處理后的第1、2、3w后，斷頸法處死實驗動物，三個時相每組隨機

5、選取5只，獲取股骨組織標本，并提取總蛋白，和總RNA并反轉錄合成cDNA，使用實時定量熒光PCR法和Western blot檢測法，檢測3個時間階段中各組大鼠股骨骨組織中CGRP mRNA和蛋白的相對表達水平，收集數(shù)據(jù)，采用spss19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析、處理。
　　研究結果：
　　1.實驗處理的3個時間相，與A組（空白對照組）比較，C組(CGRP-MSCs移植治療處理組)和D組（CGRP-MSCs+NGF移植治療處理）中

6、CGRP的CGRP mRNA和蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P＜0.01);
　　2.實驗處理1周后，C（CGRP-MSCs移植處理）和D（CGRP-MSCs+NGF移植處理）組上調(diào)水平差異明顯(P＜0.01)，D組CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表達水平低于C組;在實驗處理2周后，C組和D組之間仍保持顯著差異(P＜0.05)，D組CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表達水平仍低于C組;
　　3.實驗處理3周后，C組和D組CG

7、RP的CGRP mRNA和蛋白的表達水平上調(diào)水平差異明顯縮小，二者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　研究結論：
　　1.無論是否使用外源性NGF，CGRP轉基因骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療骨質(zhì)疏松大鼠，實驗大鼠在CGRP的CGRP mRNA和蛋白的表達水平均提高，治療效果肯定。
　　2.外源性使用NGF聯(lián)合CGRP轉基因-MSCs移植治療骨質(zhì)疏松大鼠中，至少在CGRP的CGRP mRNA和蛋白表達層面，未表現(xiàn)出促進作