PRRSV GP5糖基化位點(diǎn)對(duì)VLPs形成的影響及免疫原性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，以妊娠母豬繁殖障礙及新生仔豬的呼吸困難為主要特征。我國(guó)自2006年出現(xiàn)和流行的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株(HR-PRRSV)更是給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　病毒樣顆粒作為新型疫苗研發(fā)的平臺(tái)，其構(gòu)象更接近于天然病毒，具有良好

2、的抗體反應(yīng)性和免疫原性，且安全性更高。為了進(jìn)一步提高PRRSV VLPs的免疫特性，本研究對(duì)PRRSV BB0907株GP5的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了修飾，構(gòu)建了表達(dá)PRRSV VLPs的重組桿狀病毒，并對(duì)小鼠進(jìn)行免疫原性分析。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.PRRSV截短GP5蛋白多克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立
　　由于完整的GP5蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中難以表達(dá)，所以本研究選擇GP5蛋白C端130-200位的氨基酸進(jìn)行原核表

3、達(dá)，以純化的重組蛋白tGP5為免疫原，進(jìn)行BALB/c小鼠免疫，制備多克隆抗血清。雖然血清能夠與重組蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，而且ELISA方法檢測(cè)也顯示獲得了高效價(jià)的多克隆抗體，但病毒中和試驗(yàn)結(jié)果卻顯示該抗體沒(méi)有中和活性。
　　目前尚無(wú)有效的血清學(xué)檢測(cè)方法來(lái)評(píng)價(jià)豬群疫苗免疫或感染后抗體水平與免疫保護(hù)力之間的關(guān)系。為建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法，選擇純化的重組蛋白tGP5為包被抗原建立了檢測(cè)針對(duì)GP5蛋白抗體的ELISA方

4、法，優(yōu)化后反應(yīng)條件為:抗原包被濃度2μg/mL，37℃包被2h，5％脫脂乳37℃封閉2h，待檢血清稀釋度1∶100，37℃作用1h，二抗1∶20000稀釋，37℃作用45 min，37℃顯色3 min，抗體臨界值OD450nm≥0.22判為陽(yáng)性，OD450nm＜0.183判為陰性，介于兩者之間為可疑。特異性和重復(fù)性試驗(yàn)證明與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬口蹄疫病毒血清抗體無(wú)交叉反應(yīng)，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好。用該方法檢測(cè)判定的

5、30份陰、陽(yáng)性血清來(lái)做中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示中和試驗(yàn)判定結(jié)果與該方法不一致，說(shuō)明用E.cloi表達(dá)的130-200位的tGP5蛋白建立的間接ELISA方法不能代替中和試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)豬群抗體水平與免疫保護(hù)力之間的關(guān)系。
　　2.GP5基因糖基化位點(diǎn)對(duì)VLPs形成的影響
　　為了研究GP5糖基化位點(diǎn)對(duì)VLPs形成的影響，本研究對(duì)PRRSV GP5的四個(gè)糖基化位點(diǎn)GN30S、GN35S、GN44S、GN51S分別進(jìn)行了突變，同時(shí)在GP5基

6、因A表位和B表位之間插入一段含有27個(gè)堿基序列的HA標(biāo)簽，以GP5基因原始序列為對(duì)照，設(shè)計(jì)了8對(duì)引物，利用重疊延伸PCR擴(kuò)增目的基因片段，分別克隆至昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的pFastBac Dual載體上，經(jīng)PCR、雙酶切和基因測(cè)序鑒定得到的重組質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建共同表達(dá)M蛋白和N蛋白的重組質(zhì)粒。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH10Bac感受態(tài)細(xì)菌中，經(jīng)兩輪藍(lán)白斑篩選和菌液PCR鑒定得到重組Bacmid質(zhì)粒。最后在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將重組Bacmid

7、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞中，得到7種重組桿狀病毒。然后將6種GP5重組桿狀病毒分別與rBac-MN共同感染Sf9細(xì)胞，經(jīng)Western-blot鑒定后進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果顯示6種GP5重組桿狀病毒在電鏡下均能觀察到VLPs，說(shuō)明單個(gè)突變GP5糖基化位點(diǎn)不會(huì)影響PRRSV VLPs的組裝，A/B表位之間插入小段HA標(biāo)簽也不會(huì)影響VLPs的形成。
　　3.桿狀病毒表達(dá)的PRRSV VLPs的免疫原性分析
　　為了探討上述構(gòu)建的6種

8、PRRSV VLPs免疫特性，本研究選擇48只BALB/c小鼠，分為8組，每組6只。設(shè)Sf9細(xì)胞裂解物為陰性對(duì)照、PRRSV疫苗為陽(yáng)性對(duì)照，與上述得到的6種PRRSV VLPs同時(shí)免疫小鼠，經(jīng)三次免疫分析上述VLPs的免疫效果。每次免疫后檢測(cè)GP5蛋白ELISA抗體效價(jià)，二免、三免后均測(cè)定中和抗體的效價(jià)和細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ含量的變化。結(jié)果為:首免三周后測(cè)定的ELISA抗體較低，二免、三免后抗體水平進(jìn)一步提高，8組中rBac-G