HP-PRRSV囊膜糖蛋白5糖基化位點(diǎn)突變及功能初探.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRS首先是于20世紀(jì)80年代在美國被報(bào)道的，后來迅速在世界范圍內(nèi)傳播。PRRS可以引起豬繁殖障礙以及呼吸道癥狀，該病最開始被人們稱為“神秘病”，現(xiàn)在該病被命名為豬繁殖與呼吸綜合征。
　　PRRS的病原為PRRSV（Porcine reproductive and respi

2、ratory syndrome virus）。據(jù)報(bào)道，與其它的很多RNA病毒相比進(jìn)化的速率要快。最近時候，在中國于2006年的時候爆發(fā)了一次“豬高熱病”，造成PRRS疫病的主要病原是高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV），該病表現(xiàn)是以高發(fā)病率和高死亡率（20％）為主要臨床癥狀。為了更加深透地了解該病在我國的流行情況、2006年爆發(fā) PRRS以后的遺傳進(jìn)化特征以及HP-PRRSV可能產(chǎn)生的致病機(jī)理，因此我們開始進(jìn)行這項(xiàng)科研試驗(yàn)

3、。
　　PRRSV ORF5編碼的GP5是變異程度最高的蛋白之一，也是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)囊膜糖蛋白，對PRRSV的感染性起重要作用，是病毒增殖所必需的。GP5蛋白具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的線性表位，是目前研制PRRSV新型疫苗的良好靶蛋白。
　　有研究數(shù)據(jù)表明：PRRSV在自然感染過程中，最先激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生非中和性抗體（感染后7d左右），而中和性抗體產(chǎn)生的時間（康復(fù)豬，感染后28d左右）較晚。HP-PRRSV毒株糖基化位點(diǎn)均

4、主要存在于GP5蛋白。研究發(fā)現(xiàn)PRRSV被糖基化修飾的表位B，被糖基化修飾的。位于結(jié)構(gòu)蛋白GP5的N末端外功能區(qū)（37-44位氨基酸）；GP5還有一個免疫的優(yōu)勢表位，非中和表位A同樣是位于它的N末端（27-31位氨基酸）。有研究人員推測：表位 A干擾了由主要中和性表位 B引起免疫系統(tǒng)對其產(chǎn)生的反應(yīng)，造成中和性抗體的延遲和效價(jià)的降低。
　　有研究試驗(yàn)表明，就表位A與表位B的中間放入一個通用型輔助性T細(xì)胞表位，會造成表位B的免疫效果顯

5、著增強(qiáng)。有研究將CpG序列和通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位插入GP5表位A與表位B之間，同時并對N34、N51兩個糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變，經(jīng)小鼠免疫試驗(yàn)證明，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能刺激免疫小鼠在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生更高水平的中和抗體。
　　為了進(jìn)一步揭示HP-PRRSV囊膜糖蛋白5糖基化氨基酸突變及功能。本試驗(yàn)以含有PRRSV ORF5質(zhì)粒（pVAX1-SX-1-ORF5）為模板，根據(jù)定點(diǎn)突變的原理，通過融合PCR方法對GP5蛋白第30、34

6、、35、44、51位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，替換原始GP5蛋白中相應(yīng)的氨基酸，分別獲得重組質(zhì)粒 pVAX1-N30A、pVAX1-N34A、pVAX1-N35A、pVAX1-N44A、pVAX1-N51A。分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第12、24、36、48小時收集細(xì)胞樣品，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后通過RT-qPCR方法擴(kuò)增病毒GP5蛋白的編碼序列，序列分析顯示構(gòu)建正確。RT-qPCR結(jié)果表明GP5糖基化位點(diǎn)突變影響PRRSV

7、的轉(zhuǎn)錄水平。同時，轉(zhuǎn)染后第24、36小時收集的細(xì)胞樣品應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，進(jìn)一步了解PRRSV GP5蛋白是否誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，PRRSV GP5蛋白不同糖基化位點(diǎn)突變株的獲得將為進(jìn)一步揭示GP5蛋白糖基化位點(diǎn)氨基酸突變在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制等方面的功能變化奠定基礎(chǔ)。
　　因此，本試驗(yàn)針對HP-PRRSV SX-1株中GP5蛋白不同的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，結(jié)果表明這些位點(diǎn)的突變對GP5蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡