重組丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的表達(dá)及免疫原性.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重組丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的表達(dá)及免疫原性姓名：彭梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：戴長(zhǎng)柏陳元鼎2001.5.1中目協(xié)E#^#中目E掌抖掌院目R|：論文為了探索HCVEb大片段抗原與保守小片段抗原表位間免疫原性的差別，我們克隆了E1區(qū)一段410bp長(zhǎng)的基因片段，該片段包含將進(jìn)一步在本論文第三部分進(jìn)行研究的HCVEl區(qū)保守的14個(gè)氨基酸抗原表位的編碼區(qū)。所獲得的重組質(zhì)粒pET—HCV—Eb在大

2、腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約占菌體蛋白的31％。WesternBlot實(shí)驗(yàn)表明，該重組蛋白可被與FHV外殼蛋白融合表達(dá)的E1區(qū)重組抗原表位RNA—LI～El、RNA—EE誘導(dǎo)產(chǎn)生的豚鼠抗HCVE1表位抗體(見(jiàn)本研究第三部分)特異結(jié)合。純化的HCV—Eb重組蛋白免疫動(dòng)物后產(chǎn)生較高滴度的抗HCVEb特異抗體，該抗體用于本研究第三部分進(jìn)行交叉檢測(cè)。HCV—Eb重組抗原與RNA—C重組抗原表位檢測(cè)病人血清的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測(cè)丙型肝炎病

3、人血清抗一HCV抗體的敏感性和特異性因所選擇抗原片段的區(qū)域和大小不同而異。我們用化學(xué)法人工合成了HCVE1區(qū)高度保守的14個(gè)氨基酸E315—328(保守率為955％)的抗原表位基因。分別將該抗原表位插入昆蟲(chóng)病毒F10ckhouseviFUS(FHV)外殼蛋白表面的6個(gè)不同位置上：Il(aal09)、12(aal56)、13(aa305)、L1(aa205)、L2(aa270)、L3(aal31)：之后，為增加抗原表位的拷貝數(shù)，又將編碼F

4、HV外殼蛋白分子的RNA2載體上含有EI抗原表位基因的11、12、13、L2、L3五個(gè)位點(diǎn)串聯(lián)起來(lái)，以上所構(gòu)建的7個(gè)重組質(zhì)粒分別利用pET一3a在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得穩(wěn)定高效表達(dá)，所表達(dá)目的嵌合蛋白占菌體總蛋白40％以上。WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明：分別在各個(gè)位點(diǎn)插入了單一E1表位及串聯(lián)表位的重組抗原都能被HCV—Eb重組蛋白誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生的抗血清及丙型肝炎病人血清特異識(shí)別并結(jié)合；之后，進(jìn)一步分析抗原表位所處的不同空間

5、位置與其抗原性問(wèn)的關(guān)系，用復(fù)性的E1單一表位與串聯(lián)表位重組抗原檢測(cè)HCV病人血清及這兩個(gè)重組抗原的復(fù)性和變性蛋白檢測(cè)HCV—Eb重組抗原免疫豚鼠抗血清的ELISA結(jié)果都提示：相同的抗原表位插入FHV外殼蛋白的不同位置后可能導(dǎo)致抗原表位的空間構(gòu)象有所改變，進(jìn)而對(duì)其抗原性產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)對(duì)重組HCVEl抗原表位的抗原性研究結(jié)果，選出抗原性較好的含單一表位的RNA～L卜E1及串聯(lián)表位的RNAEE重組抗原純化后免疫動(dòng)物，證明了這兩個(gè)重組抗原