PRRSV GP5蛋白AB表位基因表達(dá)與體液免疫特性研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病，以母豬的生殖障礙和生長(zhǎng)豬及仔豬的嚴(yán)重呼吸道疾病為主要特征。是目前危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。PRRSV屬于尼多病毒目、動(dòng)脈炎病毒科，為有囊膜的不分節(jié)段、單股、正鏈RNA病毒。該病毒有4種糖基化蛋白GP2、GP3、GP4和GP5，以及2種非糖基化

2、蛋白M和N蛋白，其中GP5蛋白是PRRSV的主要保護(hù)性抗原，在動(dòng)物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。GP5蛋白的外結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)高度保守的線性中和表位，即B表位(Aa37-45)(HLQLIYNL)和一高變異性的免疫優(yōu)勢(shì)非中和表位稱為A表位，A表位的核心(Aa27-31)(A/VLAN)位于B表位的七個(gè)氨基酸之前。 為進(jìn)一步研究GP5蛋白中和表位與非中和表位的關(guān)系，本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的PRRSV S1毒株GP5的基因序列，設(shè)計(jì)合成

3、了一對(duì)含有BamHI、EcoR I酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增其A、B抗原表位141bp雙鏈DNA序列，分別克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和真核表達(dá)載體pcDNA3中，經(jīng)酶切鑒定及DNA序列測(cè)定，插入片段具有正確的閱讀框。原核重組質(zhì)粒pGEX-GP5AB轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21感受態(tài)細(xì)胞，以異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)18℃誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-GP5AB。SDS-PAGE電泳顯示相對(duì)分子質(zhì)量為30KD。用

4、GSTrap FF親和層析柱獲得的純化的蛋白，經(jīng)Westernblotting檢測(cè)證明該重組蛋白具有良好的抗原性。將純化的重組蛋白GST-GP5AB和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GP5AB分5次免疫BALB/c小鼠，每次間隔3周，最后一次免疫后用ELISA、病毒中和試驗(yàn)和Western blot檢測(cè)抗PRRSV抗體。結(jié)果表明，重組GST-GP5AB蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生PRRSV特異性ELISA抗體，獲得的血清效價(jià)大約為1:880，經(jīng)GST蛋白孵

5、育后效價(jià)為1:400。Western-blot結(jié)果顯示該融合蛋白與經(jīng)過空載體pGEX-6p-1表達(dá)的GST蛋白孵育的抗血清反應(yīng)后有明顯的特異性條帶。但是此抗體沒有中和活性。同時(shí)，pcDNA3-GP5AB不能誘導(dǎo)免疫鼠產(chǎn)生PRRSV特異性抗體。 利用GST-GP5AB重組蛋白作為包被抗原，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立間接ELISA方法用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體。結(jié)果表明，其最適反應(yīng)條件為：抗原包被濃度為2μg／mL，以0

6、.15％BSA為封閉液，封閉時(shí)間37℃2h后4℃24h，血清稀釋度為1:200，37℃作用時(shí)間為60 min，酶標(biāo)抗體1:20000稀釋，37℃作用90min，37℃顯色10min。判定標(biāo)準(zhǔn)為，S／P≥0.284為陽性，≤0.26為陰性，介于二者之間為可疑。該方法與豬其他4種疾病陽性血清反應(yīng)呈陰性。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，變異系數(shù)均<7％，表明本方法具有較好的特異性和重復(fù)性。應(yīng)用本方法檢測(cè)了PRRSV活疫苗免疫仔豬不同時(shí)間血清PRRS