可注射水凝膠攜帶Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC移植治療大鼠心肌梗死及其機制研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)移植治療心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)極有發(fā)展前景，但臨床試驗結(jié)果顯示治療效果微弱，移植細胞在缺血心肌極低的滯留率和存活率是主要原因之一。對MSC進行基因修飾或使用生物材料來承載后移植可改善這一問題。Bcl-2(B-cell lymphoma2，Bcl-2)基因能抑制細胞凋亡。VEGF(Vascular Endothelial Growt

2、h Factor，VEGF)基因能促血管生成。可注射水凝膠(Injectable Hydrogel，IH)具有可注射性、生物降解性和組織細胞相容性，能承載細胞進行移植。
　　目的:
　　使用IH聯(lián)合Bcl-2和VEGF雙基因修飾擬提高MSC移植對MI的療效，為臨床使用提供實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:
　　1、PCR擴增獲取Bcl-2和VEGF基因并使用T2A序列連接以實現(xiàn)雙基因的共表達。構(gòu)建能同時攜帶B

3、cl-2和VEGF基因的慢病毒載體并篩選構(gòu)建能穩(wěn)定過表達Bcl-2和VEGF基因的SD大鼠MSC。熒光定量PCR和Western blot結(jié)果證實Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC對比Bcl-2或VEGF單基因表達MSC對Bcl-2和VEGF基因有更高的表達。CCK-8結(jié)果說明Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC對比Bcl-2或VEGF單基因表達MSC增殖更快。
　　2、體外糖氧剝奪（Oxygen and Glucose D

4、eprivation，OGD）模型模擬體內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境，實驗分為五組:MSC-GFP組、MSC-VEGF組、MSC-Bcl-2組、MSC-BV組、MSC-GFP正常培養(yǎng)組。AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術(shù)和Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3，結(jié)果表明OGD誘發(fā)了MSC的凋亡，Bcl-2或VEGF單基因修飾的MSC凋亡減少，Bcl-2和VEGF雙基因修飾的MSC-BV較

5、Bcl-2或VEGF單基因修飾的MSC凋亡減少更顯著。ELISA結(jié)果顯示Bcl-2和VEGF雙基因修飾能增強OGD環(huán)境下MSC旁分泌VEGF，bFGF，HGF和IGF-1。
　　3、IH攜帶Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC進行對MI大鼠的移植治療，實驗分為六組:SHAM組、PBS組、IH組、MSC組、MSC+BV組、MSC+BV+IH組。細胞移植治療4周后心臟超聲結(jié)果提示MSC+BV+IH組的心臟收縮功能改善更顯著。HE和M

6、asson染色結(jié)果提示MSC+BV+IH組的梗死面積顯著縮小。cTnT免疫熒光結(jié)果提示MSC+BV+IH組心肌存活更多。TUNEL和Western blot結(jié)果提示MSC+BV+IH組心肌細胞凋亡減少更顯著。vWF和a-SMA免疫熒光結(jié)果提示MSC+BV+IH組血管密度更高。CM-Dil標記MSC移植提示MSC+BV+IH組的細胞滯留改善更明顯。
　　4、原代培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞，與MSC使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)置于1％O

7、2缺氧處理24h，實驗分為四組:心肌細胞正常培養(yǎng)組、心肌細胞缺氧組、心肌細胞+MSC+GFP缺氧組、心肌細胞+MSC+BV缺氧組。采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術(shù)、Western blot檢測凋亡蛋白Cleaved-capase-3、TUNEL分析心肌細胞凋亡，結(jié)果表明與Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC共培養(yǎng)更能減少缺氧狀態(tài)下心肌細胞的凋亡。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了Bcl-2和VEGF雙基因共表達

8、重組慢病毒載體;篩選構(gòu)建了Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC;對比Bcl-2或VEGF單基因表達MSC，其對目的基因Bcl-2和VEGF有更高的表達，更快的增殖速度。
　　2、Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC對比Bcl-2或VEGF單基因表達MSC在體外糖氧剝奪環(huán)境下發(fā)揮更好的自我保護和旁分泌作用。
　　3、Bcl-2和VEGF雙基因共表達MSC移植對心肌梗死有更好的治療作用，可注射水凝膠的承載移植進一步增強了MS