心肌梗死基因治療的實驗研究.pdf

1、研究背景 心肌梗死(myoeardial infarction,MI)后左室重構(gòu)是左室擴張和殘余的非梗死心肌肥厚等因素的綜合結(jié)果,其顯著影響心肌梗死患者的心室功能和預(yù)后.心肌梗死后患者由心功能不全發(fā)展為心力衰竭的過程中,毛細血管床與肥厚心肌組織的比例結(jié)構(gòu)失調(diào)可能發(fā)揮了重要作用.有研究報道,在非梗死區(qū),微血管生長的速度和數(shù)量不足,導(dǎo)致肥厚心肌組織的毛細血管密度下降,由此繼發(fā)氧氣供應(yīng)不足,心肌組織缺血,這將引起進行性的心肌細胞壞死、

2、梗死區(qū)擴展和心肌纖維化.左室重構(gòu)過程是決定心肌梗死患者預(yù)后的重要因素,因此各種旨在改善心肌梗死后左室重構(gòu)的研究成為近年來研究的熱點.誘導(dǎo)新血管生成已被證明是干預(yù)左室重構(gòu)病理生理過程的有效手段.研究已經(jīng)證明,某些藥物、一些促血管生成因子以及干細胞治療等均可有效誘導(dǎo)新血管生成,改善心肌梗死后左室重構(gòu)和心功能.血管生長素(Angiogenin,ANG)是一個強效的促血管生長因子,而且是血管新生過程中必不可少的因子.體外實驗證實,ANG促進內(nèi)皮

3、細胞的增殖、遷移,并在一定的培養(yǎng)條件下,形成管狀結(jié)構(gòu);活體實驗發(fā)現(xiàn)ANG可改善動物缺血肢體的血液供應(yīng);攜帶ANG的骨髓干細胞移植可促進缺血心肌血管生成、修復(fù)損傷心肌組織.然而,心肌內(nèi)轉(zhuǎn)染ANG基因?qū)π募」Ｋ绖游锬Ｐ偷挠绊懩壳吧形匆妶蟮? 目的 本研究構(gòu)建攜帶目的基因 ANG 和報告基因 laeZ 的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV-ANG和rAAV-IaeZ),建立心肌梗死大鼠模型,采用直接心肌內(nèi)注射的方法,轉(zhuǎn)染ANG基因,

4、觀察其在心肌組織的表達及其促血管生成作用、對心肌梗死大鼠左室重構(gòu)和心功能的影響. 方法 按照AAV Helper-Free System試劑盒說明書,以pAAV-ANG(或pAAV-IacZ)、pAAV-RC和pHelper質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染293細胞法包裝rAAV-ANG和rAAV-IaeZ病毒載體.成年雄性Wistar大鼠,隨機分組:正常對照組(normal)、正常大鼠心肌內(nèi)注射rAAV-ANG組(normal-r

5、AAV-ANG)、假手術(shù)組(sham-operation)、心肌梗死大鼠心肌內(nèi)注射生理鹽水組(MI-saline)、心肌梗死大鼠心肌內(nèi)注射rAAV-IaeZ組(MI-rAAV-IaeZ)和心肌梗死大鼠心肌內(nèi)注射rAAV-ANG組(MI-rAAV-ANG).以開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法建立心肌梗死模型.冠脈結(jié)扎后,立即取生理鹽水、rAAV-IaeZ或rAAV-ANG在梗死區(qū)周圍4個點注射.4周后以超聲心動圖方法檢測左室大小(左室舒張末

6、期內(nèi)徑和左室收縮末期內(nèi)徑,即LVEDD和LVESD)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),頸動脈插管測定有創(chuàng)左室血流動力學(xué)指標(biāo).大鼠處死后,測量左室重量,計算左室重量與體重比值.Western blot方法檢測各組大鼠心肌組織ANG蛋白表達水平,免疫組化方法觀察ANG蛋白在心肌組織的表達和分布.X-gal染色判斷基因轉(zhuǎn)染是否成功;免疫組化方法檢測vWF表達以評價心肌組織毛細血管密度;組織學(xué)切片上測量非梗死區(qū)心肌細胞的橫徑和心肌間質(zhì)纖維沉積指數(shù).

7、 結(jié)果 1.轉(zhuǎn)染pAAV-LacZ的陽性對照293細胞和轉(zhuǎn)染pAAV-ANG的293細胞48小時后出現(xiàn)細胞變圓、脫壁等表現(xiàn),并且培養(yǎng)基逐漸變?yōu)槌赛S色,說明有重組病毒產(chǎn)生.rAAV-ANG病毒顆粒不低于10<'12>個/ml.重組病毒感染滴度為3×10<'10>IU/ml. 2.超聲心動圖和組織學(xué)檢測證實,本研究成功建立了心肌梗死大鼠模型.大鼠心肌梗死面積在MI-saline、MI-rAAV-lacZ和MI-rAAV

8、-ANG三組間相比無顯著差異. 3.MI-rAAV-lacZ組大鼠左室心肌組織X-gal染色顯示大量心肌細胞胞漿藍染,提示這些細胞成功轉(zhuǎn)染并表達了lacZ基因.MI-rAAV-lacZ組大鼠的肝、肺、腎和腦組織切片行X-gal染色,未見陽性細胞. 4.Normal、sham-operation、MI-saline和MI-rAAV-lacZ組大鼠左室心肌組織可以檢測到低水平的ANG蛋白表達.與normal和sham-ope

9、ration組相比,normal-rAAV-ANG組和MI-rAAV-ANG組大鼠左室心肌組織ANG水平顯著升高;與MI-saline組相比,MI-rAAV-ANG組大鼠左室心肌組織ANG水平亦顯著升高,提示在正常大鼠和心肌梗死大鼠心肌組織內(nèi)局部注射的rAAV-ANG基因均能高效表達.免疫組化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANG蛋白在大鼠左室心肌細胞胞漿中彌散分布,在血管周圍可見濃集. 5.心肌梗死模型建立4周后,MI-saline和MI-rAA

10、V-lacZ組心肌組織毛細血管密度顯著低于normal和sham-operation組.正常大鼠轉(zhuǎn)染rAAV-ANG后心肌組織毛細血管密度顯著高于normal和sham-operation大鼠(P均<0.05).心肌梗死大鼠轉(zhuǎn)染rAAV-ANG基因后心肌組織毛細血管密度顯著高于MI-saline組(p<0.05),與normal組無顯著差異. 6.與normal和sham-operation組相比,正常大鼠轉(zhuǎn)染rAAV-ANG后

11、左室腔大小、左室功能、左室重量、左室重量與體重比值、左室心肌細胞橫徑和心肌間質(zhì)纖維沉積均無顯著變化. 7.與normal和sham-operation組相比,MI-saline組和MI-rAAV-lacZ組大鼠的左室重量顯著增加,左室重量與體重比值亦顯著增大.MI-rAAV-ANG組大鼠左室重量、左室重量與體重比值恢復(fù)至正常水平,與normal和sham-operation組相比無顯著差異,與MI-saline組和MI-rAAV

12、-IacZ組相比顯著降低:超聲心動圖檢測結(jié)果示,冠狀動脈左前降支結(jié)扎4周后,與normal和sham-operation組相比,所有心肌梗死大鼠均表現(xiàn)出左室腔的擴大,rAAV-ANG治療部分抑制、但未能完全阻止左室的擴大;MI-saline組和MI-rAAV-IacZ組大鼠心肌細胞橫徑顯著大于normal和sham-operation組,而MI-rAAV-ANG組心肌細胞橫徑則與normal組無顯著差異;與normal和sham-ope

13、ration大鼠相比,MI-saline組和MI-rAAV-lacZ組大鼠心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量的纖維沉積.rAAV-ANG治療顯著抑制了心肌組織纖維化,MI-rAAV-ANG組大鼠心肌組織纖維沉積百分比顯著低于MI-saline組,且與normal組無顯著差別. 8.與normal和sham-operation組相比,所有心肌梗死大鼠(MI-saline、MI-rAAV-lacZ和MI-rAAV-ANG 3個組)均表現(xiàn)出顯著降低的L

14、VEF、LVSP和±dp/dt<,max>,以及顯著升高的LVEDP,表明其左室收縮和舒張功能均顯著降低.與MI-saline和MI-rAAV-IacZ組相比,MI-rAAV-ANG組左室LVEF、LVSP和±dp/dt<,max>顯著提高,同時LVEDP降低,提示rAAV-ANG轉(zhuǎn)染顯著改善了左室功能. 結(jié)論 1.結(jié)扎冠狀動脈左前降支4周后,大鼠出現(xiàn)顯著的左室重構(gòu),包括左室重量增加、左室腔擴大、非梗死區(qū)心肌細胞橫徑增加

15、和心肌間質(zhì)纖維沉積增多,伴有毛細血管密度下降.同時,心肌梗死大鼠的左室功能顯著下降. 2.正常大鼠心肌內(nèi)注射rAAV-ANG載體后,心肌組織ANG蛋白表達增加,毛細血管密度增加,但心功能和左室重構(gòu)指標(biāo)無顯著變化. 3.心肌梗死大鼠心肌內(nèi)注射rAAV-ANG載體后,心肌組織.ANG蛋白表達增加,非梗死區(qū)毛細血管密度恢復(fù)正常,左室重構(gòu)減輕(左室重量、左室內(nèi)徑、非梗死區(qū)心肌細胞橫徑和間質(zhì)纖維沉積完全或部分恢復(fù)),同時,心功能明