骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死及免疫炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、背景： 急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)目前已成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。盡管冠心病治療學(xué)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但是AMI的治療現(xiàn)狀仍不容樂(lè)觀。近年來(lái)，骨髓干細(xì)胞移植技術(shù)在心血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用為AMI提供了全新的治療策略。動(dòng)物和臨床研究的初步結(jié)果均證實(shí)骨髓干細(xì)胞治療AMI安全、有效，然而由于對(duì)其治療機(jī)制認(rèn)識(shí)的不足，致使目前許多研究問(wèn)題無(wú)法解決，如移植時(shí)機(jī)的選擇、移植途徑的選擇等。進(jìn)

2、一步明確其治療機(jī)制是推動(dòng)骨髓干細(xì)胞移植技術(shù)前進(jìn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此在現(xiàn)有已知治療機(jī)制的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討潛在的未知機(jī)制是骨髓干細(xì)胞移植領(lǐng)域的主要研究方向之一。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mescnchymal stem cells，BMSCs)具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性，移植到體內(nèi)后可以調(diào)節(jié)受體免疫炎癥反應(yīng)。AMI后伴隨有強(qiáng)烈的免疫炎癥反應(yīng)，其在梗死后心室重構(gòu)過(guò)程中起著重要的推動(dòng)作用。BMSCs移植治療心肌梗

3、死的機(jī)制是否也與調(diào)節(jié)梗死心臟炎癥反應(yīng)有關(guān)，目前并不清楚。因此，進(jìn)一步明確BMSCs對(duì)心肌梗死后免疫炎癥反應(yīng)的影響有可能揭示BMSCs治療心肌梗死的新機(jī)制。 目的： (1)探討AMI炎癥反應(yīng)期內(nèi)移植BMSCs對(duì)心肌梗死的治療效果：觀察其在AMI后炎癥環(huán)境中存活和分化情況：并觀察其對(duì)心肌梗死后早期重構(gòu)的影響。 (2)探討B(tài)MSCs對(duì)AMI后病理性免疫炎癥反應(yīng)的影響，分別觀察BMSCs移植對(duì)AMI大鼠脾臟淋巴細(xì)胞殺傷心

4、肌細(xì)胞和心肌炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 方法： (一)大鼠BMSCs提取、擴(kuò)增和鑒定1.BMSCs提取和擴(kuò)增：取體質(zhì)量120～150g健康清結(jié)級(jí)雄性SD大鼠若干只，無(wú)菌條件下取其骨髓，采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)的方法分離BMSCs，并進(jìn)行傳代擴(kuò)增。2.BMSCs鑒定：分別通過(guò)體外成骨和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原(CD29、CD34、CD45和CD105)表達(dá)情況，鑒定提取的骨髓細(xì)胞。 (二

5、)AMI后即刻移植BMSCs對(duì)心肌梗死的療效觀察1.BMSCs體外標(biāo)記：采用BrdU標(biāo)記法體外標(biāo)記BMSCs。標(biāo)記后檢測(cè)標(biāo)記陽(yáng)性率，消化細(xì)胞調(diào)整密度為1×107個(gè)/mL，移植備用。2.AMI模型制作和BMSCs移植：采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法復(fù)制大鼠AMI模型，模型制作成功即刻通過(guò)心外膜直接注射的方法將BrdU標(biāo)記好的BMSCs分四點(diǎn)注射到梗死心肌周邊部位，每點(diǎn)注射0.1mL，對(duì)照組采用相同方法注射等體積的PBS緩沖溶液，同時(shí)部分大鼠

6、開(kāi)胸后僅穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支作為假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)過(guò)程隨機(jī)進(jìn)行，將圍手術(shù)期內(nèi)死亡大鼠排除在外(認(rèn)為與手術(shù)和麻醉相關(guān))，最后每組剩余實(shí)驗(yàn)大鼠各8只，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)分析。3.心臟超聲檢測(cè)：分別在AMI后1天和4周末，通過(guò)心臟超聲檢查評(píng)價(jià)大鼠心臟功能。4.血流動(dòng)力學(xué)檢查：AMI后4周末，麻醉后通過(guò)右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈插管方法，用生理記錄儀記錄大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)心臟功能。5.組織標(biāo)本留?。?1)血流動(dòng)力學(xué)檢查完畢后，處死各組大鼠，收集心臟標(biāo)本

7、，并進(jìn)行分割，部分心肌組織置-80℃低溫保存，部分心肌組織采用多聚甲醛固定、石蠟包埋。(2)同時(shí)無(wú)菌條件下取出大鼠脾臟，立刻分離脾臟淋巴細(xì)胞，用于淋巴細(xì)胞殺傷效應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。6.組織學(xué)染色檢查：取部分心肌標(biāo)本行HE染色和Masson trichrome染色，觀察心肌梗死情況，測(cè)量心肌梗死面積、梗死部位室壁厚度和梗死膨脹指數(shù)。7.移植細(xì)胞存活和分化情況檢測(cè)：取部分心肌標(biāo)本進(jìn)行抗BrdU免疫組化染色，觀察移植細(xì)胞存活情況；另取部分心肌組織行抗

8、BrdU和抗cTnI免疫熒光雙染，觀察移植細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化情況。8.梗死心臟膠原蛋白表達(dá)情況檢測(cè)：分別采用RT-PCR和western blot方法測(cè)量梗死部位和非梗死部位組織中I型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步評(píng)價(jià)心室重構(gòu)。 (三)BMSCs對(duì)AMI大鼠淋巴細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響1.脾臟淋巴細(xì)胞體外殺傷心肌細(xì)胞檢測(cè)：(1)出生2天內(nèi)的SD乳鼠若干只，分離出心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞：(2)將提取的脾臟淋巴細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞(或非心肌

9、細(xì)胞)體外共培養(yǎng)(細(xì)胞密度10:1)，采用結(jié)晶紫法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞(非心肌細(xì)胞)的體外殺傷效應(yīng)。2.AMI后淋巴細(xì)胞向梗死心臟浸潤(rùn)情況分析：取心肌組織標(biāo)本，行HE染色后觀察梗死區(qū)和非梗死區(qū)組織內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。 (四)BMSCs對(duì)梗死心肌炎性因子表達(dá)的影響1.免疫組化染色：取部分心肌標(biāo)本，分別行抗白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-10和腫瘤壞死因子a(tumor necrosis fa

10、ctor-a，TNF-a)免疫組化染色，觀察心肌組織中炎性因子的表達(dá)情況。2.炎性因子mRNA表達(dá)情況檢測(cè)：取梗死周邊區(qū)心肌組織，采用RT-PCR法分別檢測(cè)心肌組織中IL-6、IL-10和TNF-a mRNA表達(dá)情況。3.炎性因子蛋白表達(dá)定量檢測(cè)：取梗死周邊區(qū)心肌組織，采用wostcrn blot法半定量檢測(cè)心肌組織中IL-6、IL-10和TNF-a蛋白表達(dá)情況。4.心肌組織核因子kB活性檢測(cè)：取梗死周邊區(qū)心肌組織，采用western

11、blot法檢測(cè)心肌組織核因子kB活性。 結(jié)果： 1.大鼠BMSCs提取、擴(kuò)增和鑒定：通過(guò)密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)方法提取的骨髓細(xì)胞具有旺盛的增殖能力；在特殊培養(yǎng)條件誘導(dǎo)下可以分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞；流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示提取細(xì)胞高度表達(dá)CD29(80.10％)和CD105(85.20％)，低水平表達(dá)CD34(15.86％)和CD45(10.50％)。 2.BMSCs移植對(duì)AMI的療效觀察：(1)BMSCs經(jīng)BrdU標(biāo)

12、記后，陽(yáng)性率在85％左右。(2)AMI后即刻移植的BMSCs可以在受體心臟內(nèi)存活至少4周，研究中未檢測(cè)到移植細(xì)胞向心肌細(xì)胞發(fā)生分化。(3)與MI+PBS組相比，MI+BMSCs組梗死面積明顯縮小[(38.39±2.77)％比(45.83±3.08)％，P<0.001]，梗死區(qū)室壁厚度增加[(2.3±0.3)mm比(1.5±0.5)mm，P<0.01]，心室重構(gòu)明顯減輕[LVEDD(mm)：(6.45±0.47)比(7.81±0.31)，

13、P<0.05；心臟/體質(zhì)量(mg/g)：(2.99±0.10)比0.21±0.06)，P<0.01；梗死膨脹指數(shù)：(1.37±0.24)比(2.20±0.22)，P<0.001]，心功能的惡化得到一定程度延緩[EF％：(30.76±3.39)比(24.06±4.71)，P<0.05；FS％：(29.33±4.87)比(23.05±3.94)，P<0.05；LVEDP(mmHg)：(12.35±4.87)比(19.83+4.91)，P<0

14、.01：+dp/dtmax(mmHg/s)：(4591.63±415.38)比(3887.75±275.62)，P<0.01；-dp/dtmax(mmHg/s)：(4242.13±273.93)比(3480.88±346.44)，P<0.01]，但研究中未觀察到心功能的明顯改善。(4)BMSCs對(duì)梗死心臟膠原蛋白沉積具有雙重調(diào)節(jié)作用，一方面可以促進(jìn)梗死部位膠原蛋白沉積，增加梗死區(qū)室壁厚度，另一方面可以抑制非梗死區(qū)膠原蛋白的沉積。

15、 3.BMSCs移植對(duì)AMI大鼠脾臟淋巴細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響：(1)AMI 4周末，大鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外可以特異性殺傷乳鼠心肌細(xì)胞，BMSCs移植可以減輕大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[MI+PBS：(47.20±5.13)％，MI+BMSCs：(34.28±6.13)％，P<0.05].(2)AMI 4周末，梗死區(qū)和非梗死區(qū)均可以檢測(cè)到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 4.BMSCs移植對(duì)AMI大鼠心肌炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響：(1)AMI 4周末，心

16、肌組織中IL-6、IL-10和TNF-a炎性細(xì)胞因子表達(dá)明顯增加，同時(shí)伴隨核因子kB活性增強(qiáng)。(2)BMSCs移植可以在一定程度上下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-a的表達(dá)，并上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，同時(shí)可以在一定程度上抑制核因子kB的激活。 結(jié)論： 1.采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法可以獲得相對(duì)均一的BMSCs。 2.AMI后即刻移植BMSCs可以在受體心肌中存活，并且可以抑制梗死后心室重構(gòu)，延緩心功能