骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠急性心肌梗死及免疫炎癥調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、背景： 急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)目前已成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。盡管冠心病治療學取得了長足進步，但是AMI的治療現(xiàn)狀仍不容樂觀。近年來，骨髓干細胞移植技術在心血管疾病領域的應用為AMI提供了全新的治療策略。動物和臨床研究的初步結果均證實骨髓干細胞治療AMI安全、有效，然而由于對其治療機制認識的不足，致使目前許多研究問題無法解決，如移植時機的選擇、移植途徑的選擇等。進

2、一步明確其治療機制是推動骨髓干細胞移植技術前進的關鍵環(huán)節(jié)。因此在現(xiàn)有已知治療機制的基礎上進一步探討潛在的未知機制是骨髓干細胞移植領域的主要研究方向之一。 近年來研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mescnchymal stem cells，BMSCs)具有獨特的免疫調(diào)節(jié)特性，移植到體內(nèi)后可以調(diào)節(jié)受體免疫炎癥反應。AMI后伴隨有強烈的免疫炎癥反應，其在梗死后心室重構過程中起著重要的推動作用。BMSCs移植治療心肌梗

3、死的機制是否也與調(diào)節(jié)梗死心臟炎癥反應有關，目前并不清楚。因此，進一步明確BMSCs對心肌梗死后免疫炎癥反應的影響有可能揭示BMSCs治療心肌梗死的新機制。 目的： (1)探討AMI炎癥反應期內(nèi)移植BMSCs對心肌梗死的治療效果：觀察其在AMI后炎癥環(huán)境中存活和分化情況：并觀察其對心肌梗死后早期重構的影響。 (2)探討B(tài)MSCs對AMI后病理性免疫炎癥反應的影響，分別觀察BMSCs移植對AMI大鼠脾臟淋巴細胞殺傷心

4、肌細胞和心肌炎性細胞因子表達的影響。 方法： (一)大鼠BMSCs提取、擴增和鑒定1.BMSCs提取和擴增：取體質(zhì)量120～150g健康清結級雄性SD大鼠若干只，無菌條件下取其骨髓，采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)的方法分離BMSCs，并進行傳代擴增。2.BMSCs鑒定：分別通過體外成骨和成脂肪細胞誘導分化培養(yǎng)以及流式細胞儀檢測細胞表面抗原(CD29、CD34、CD45和CD105)表達情況，鑒定提取的骨髓細胞。 (二

5、)AMI后即刻移植BMSCs對心肌梗死的療效觀察1.BMSCs體外標記：采用BrdU標記法體外標記BMSCs。標記后檢測標記陽性率，消化細胞調(diào)整密度為1×107個/mL，移植備用。2.AMI模型制作和BMSCs移植：采用結扎冠狀動脈前降支的方法復制大鼠AMI模型，模型制作成功即刻通過心外膜直接注射的方法將BrdU標記好的BMSCs分四點注射到梗死心肌周邊部位，每點注射0.1mL，對照組采用相同方法注射等體積的PBS緩沖溶液，同時部分大鼠

6、開胸后僅穿線不結扎冠狀動脈前降支作為假手術組。實驗過程隨機進行，將圍手術期內(nèi)死亡大鼠排除在外(認為與手術和麻醉相關)，最后每組剩余實驗大鼠各8只，進入實驗分析。3.心臟超聲檢測：分別在AMI后1天和4周末，通過心臟超聲檢查評價大鼠心臟功能。4.血流動力學檢查：AMI后4周末，麻醉后通過右側頸內(nèi)動脈插管方法，用生理記錄儀記錄大鼠心臟血流動力學指標，進一步評價心臟功能。5.組織標本留?。?1)血流動力學檢查完畢后，處死各組大鼠，收集心臟標本

7、，并進行分割，部分心肌組織置-80℃低溫保存，部分心肌組織采用多聚甲醛固定、石蠟包埋。(2)同時無菌條件下取出大鼠脾臟，立刻分離脾臟淋巴細胞，用于淋巴細胞殺傷效應檢測實驗。6.組織學染色檢查：取部分心肌標本行HE染色和Masson trichrome染色，觀察心肌梗死情況，測量心肌梗死面積、梗死部位室壁厚度和梗死膨脹指數(shù)。7.移植細胞存活和分化情況檢測：取部分心肌標本進行抗BrdU免疫組化染色，觀察移植細胞存活情況；另取部分心肌組織行抗

8、BrdU和抗cTnI免疫熒光雙染，觀察移植細胞向心肌細胞的分化情況。8.梗死心臟膠原蛋白表達情況檢測：分別采用RT-PCR和western blot方法測量梗死部位和非梗死部位組織中I型和Ⅲ型膠原蛋白表達情況，進一步評價心室重構。 (三)BMSCs對AMI大鼠淋巴細胞殺傷效應的影響1.脾臟淋巴細胞體外殺傷心肌細胞檢測：(1)出生2天內(nèi)的SD乳鼠若干只，分離出心肌細胞和非心肌細胞：(2)將提取的脾臟淋巴細胞和乳鼠心肌細胞(或非心肌

9、細胞)體外共培養(yǎng)(細胞密度10:1)，采用結晶紫法檢測脾臟淋巴細胞對乳鼠心肌細胞(非心肌細胞)的體外殺傷效應。2.AMI后淋巴細胞向梗死心臟浸潤情況分析：取心肌組織標本，行HE染色后觀察梗死區(qū)和非梗死區(qū)組織內(nèi)淋巴細胞的浸潤情況。 (四)BMSCs對梗死心肌炎性因子表達的影響1.免疫組化染色：取部分心肌標本，分別行抗白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、IL-10和腫瘤壞死因子a(tumor necrosis fa

10、ctor-a，TNF-a)免疫組化染色，觀察心肌組織中炎性因子的表達情況。2.炎性因子mRNA表達情況檢測：取梗死周邊區(qū)心肌組織，采用RT-PCR法分別檢測心肌組織中IL-6、IL-10和TNF-a mRNA表達情況。3.炎性因子蛋白表達定量檢測：取梗死周邊區(qū)心肌組織，采用wostcrn blot法半定量檢測心肌組織中IL-6、IL-10和TNF-a蛋白表達情況。4.心肌組織核因子kB活性檢測：取梗死周邊區(qū)心肌組織，采用western

11、blot法檢測心肌組織核因子kB活性。 結果： 1.大鼠BMSCs提取、擴增和鑒定：通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)方法提取的骨髓細胞具有旺盛的增殖能力；在特殊培養(yǎng)條件誘導下可以分化成骨細胞和脂肪細胞；流式細胞檢測結果顯示提取細胞高度表達CD29(80.10％)和CD105(85.20％)，低水平表達CD34(15.86％)和CD45(10.50％)。 2.BMSCs移植對AMI的療效觀察：(1)BMSCs經(jīng)BrdU標

12、記后，陽性率在85％左右。(2)AMI后即刻移植的BMSCs可以在受體心臟內(nèi)存活至少4周，研究中未檢測到移植細胞向心肌細胞發(fā)生分化。(3)與MI+PBS組相比，MI+BMSCs組梗死面積明顯縮小[(38.39±2.77)％比(45.83±3.08)％，P<0.001]，梗死區(qū)室壁厚度增加[(2.3±0.3)mm比(1.5±0.5)mm，P<0.01]，心室重構明顯減輕[LVEDD(mm)：(6.45±0.47)比(7.81±0.31)，

13、P<0.05；心臟/體質(zhì)量(mg/g)：(2.99±0.10)比0.21±0.06)，P<0.01；梗死膨脹指數(shù)：(1.37±0.24)比(2.20±0.22)，P<0.001]，心功能的惡化得到一定程度延緩[EF％：(30.76±3.39)比(24.06±4.71)，P<0.05；FS％：(29.33±4.87)比(23.05±3.94)，P<0.05；LVEDP(mmHg)：(12.35±4.87)比(19.83+4.91)，P<0

14、.01：+dp/dtmax(mmHg/s)：(4591.63±415.38)比(3887.75±275.62)，P<0.01；-dp/dtmax(mmHg/s)：(4242.13±273.93)比(3480.88±346.44)，P<0.01]，但研究中未觀察到心功能的明顯改善。(4)BMSCs對梗死心臟膠原蛋白沉積具有雙重調(diào)節(jié)作用，一方面可以促進梗死部位膠原蛋白沉積，增加梗死區(qū)室壁厚度，另一方面可以抑制非梗死區(qū)膠原蛋白的沉積。

15、 3.BMSCs移植對AMI大鼠脾臟淋巴細胞殺傷效應的影響：(1)AMI 4周末，大鼠脾臟淋巴細胞體外可以特異性殺傷乳鼠心肌細胞，BMSCs移植可以減輕大鼠脾臟淋巴細胞的殺傷效應[MI+PBS：(47.20±5.13)％，MI+BMSCs：(34.28±6.13)％，P<0.05].(2)AMI 4周末，梗死區(qū)和非梗死區(qū)均可以檢測到淋巴細胞浸潤。 4.BMSCs移植對AMI大鼠心肌炎性細胞因子表達的影響：(1)AMI 4周末，心

16、肌組織中IL-6、IL-10和TNF-a炎性細胞因子表達明顯增加，同時伴隨核因子kB活性增強。(2)BMSCs移植可以在一定程度上下調(diào)促炎細胞因子IL-6和TNF-a的表達，并上調(diào)抗炎細胞因子IL-10的表達，同時可以在一定程度上抑制核因子kB的激活。 結論： 1.采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法可以獲得相對均一的BMSCs。 2.AMI后即刻移植BMSCs可以在受體心肌中存活，并且可以抑制梗死后心室重構，延緩心功能