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文檔簡介
1、目的:采用兔耳緣靜脈注射異丙腎上腺素(Isoprenaline,ISO)建立兔心力衰竭(hea rt fa ilure,HF)模型;探討HF時,兔心室肌細胞的晚鈉電流( Late Sod ium Current,INaL)的變化及 KN-93(CaMKII抑制劑)對 INaL的影響;同時檢測心室肌組織內(nèi)CaMKIIδ、磷酸化CaMKIIδ、Nav1.5、AnkyrinG的表達及CaMKIIδ和AnkyrinG定位情況;闡明HF時CaMK
2、IIδ可能通過AnkyrinG調(diào)控晚鈉通道,誘導心律失常的產(chǎn)生。
方法:實驗用日本大耳白兔,雌雄不拘,隨機分為 HF組和對照組(每組12只)。HF組兔經(jīng)耳緣靜脈注射ISO(300μg·kg-1·d-1),連續(xù)注射15天;對照組兔經(jīng)耳緣靜脈注射等體積0.9%生理鹽水(1ml·kg-1·d-1),連續(xù)注射15天;注射完成后,均自由進食給水。(1)建立模型1月后進行超聲心動圖檢查、ELISA法檢測兔血漿BN P含量、H E染色觀察心
3、肌病理改變等來評價HF模型是否建立成功;(2)分離對照組和HF組兔心室肌細胞,采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄INaL;(3)通過Western blotting檢測CaMKIIδ、磷酸化CaMKIIδ、Nav1.5及AnkyrinG的表達;(4)qRT-PCR檢測CaMKIIδ、Nav1.5及AnkyrinGmRNA表達;(5)石蠟切片免疫熒光雙標法標記CaMKIIδ和AnkyrinG,觀察其定位情況。
結(jié)果:1)造模一般結(jié)果:HF
4、組兔在注射ISO造模過程中死亡3只、對照組兔無死亡,建立模型成功率為75.0%;與對照組相比, HF組兔的心率增加較明顯(P<0.01)。2)心臟超聲結(jié)果顯示:與對照組相比較,HF組心室腔增大、心功能降低;HF組LVEF(46.52±7.18%)較對照組(65.52±4.09%)明顯下降且小于50%(P<0.01);HF組LVFS(21.14±3.70%)較對照組(32.58±2.84%)明顯下降(P<0.01)。3)兔血漿BNP含量結(jié)
5、果:HF組血漿BNP含量(391.40±38.59pg/ml)較對照組(234.49±31.68pg/ml)明顯增加(P<0.01)。4)HE染色顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):對照組心室肌細胞呈長梭形、排列整齊,細胞之間的界限清楚,可見心肌橫紋;HF組心室肌細胞排列紊亂、無規(guī)則,可見心室肌細胞呈空泡樣變性及心室肌細胞間質(zhì)水腫、纖維組織增多。5)全細胞膜片鉗發(fā)現(xiàn):HF組的INaL(-1.64±0.30pA/pF)與對照組(-0.70±0.17pA/p
6、F)相比明顯增加(P<0.01);分別加入30nM ATXII(INaL激動劑)后,HF組中ATXII組與空白對照相比INaL明顯增加、對照組中ATXII組INaL也明顯增高,并且HF組比對照組增加更明顯(P<0.01);在ATXII誘導電流增加穩(wěn)定后,分別加入1μM KN-93(CaMKII抑制劑)后,對照組中經(jīng)ATXII誘導增加的INaL由(-1.39±0.29pA/pF)減少至(-0.99±0.28pA/pF),且P<0.05、H
7、F組中經(jīng)ATXII誘導增加的INaL由(-2.27±0.22pA/pF)減少至(-1.87±0.25pA/pF),且P<0.01。6)Western blotting結(jié)果示:HF組的心室肌組織CaMKIIδ、磷酸化CaMKIIδ、Nav1.5及AnkyrinG蛋白表達與對照組相比均明顯增加( P<0.01)。7) q RT-PCR結(jié)果顯示:HF組中CaMKIIδ、Nav1.5和AnkyrinG mRNA表達量明顯高于對照組(P<0.01
8、)。8)免疫熒光雙標結(jié)果示:對照組和HF組均有綠色及紅色熒光,且HF組的綠色及紅色熒光與對照組相比熒光更強;對照組和HF組的綠色及紅色熒光均分布在細胞內(nèi),兩者在細胞膜上的同一部位表達更明顯,這表明CaMKIIδ和AnkyrinG共同表達在細胞膜上。
結(jié)論:1、異丙腎上腺素誘導的兔HF中,不僅Nav1.5表達上調(diào),而且INaL也會增大。2、HF時,CaMKIIδ表達及活性增加,且使用CaMKII的抑制劑KN-93能減少INaL,
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