青蒿琥酯對宮頸癌U14細(xì)胞移植瘤VEGF及COX-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的:子宮頸癌為最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年在發(fā)展中國家發(fā)病年齡有年輕化趨勢。通過手術(shù)及放化療的方法雖可改善早期宮頸癌預(yù)后，但對導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)移性宮頸癌，其療效尚不理想。手術(shù)相對創(chuàng)傷較大而化療藥物長期大量應(yīng)用可能導(dǎo)致毒性積累，副反應(yīng)加重甚至化療藥物耐藥，因此尋找高效、無毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點(diǎn)。
　　血管生成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過程，在創(chuàng)傷修復(fù)、生長發(fā)育及生殖中占據(jù)重要位置。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長

2、因子(VEGF)及環(huán)氧合酶2（COX-2）是與腫瘤血管生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　青蒿琥酯（ART）已證實(shí)對于肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)腸癌、白血病、黑色素瘤、腎臟腫瘤等腫瘤細(xì)胞具有良好療效[1]，且副作用小于傳統(tǒng)化療藥物。目前體外研究證實(shí)，青蒿琥酯可通過抑制腫瘤組織血管生成，從而抑制腫瘤生長。本實(shí)驗(yàn)通過研究青蒿琥酯作用下宮頸癌 U14移植瘤VEGF及COX-2的表達(dá)變化及其與微血管密度（MVD）的相關(guān)

3、性，探究青蒿琥酯是否可通過抑制血管生成而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。
　　方法：
　　1.移植瘤動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組
　　收集對數(shù)生長期 U14細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107/ml，接種于小鼠腹腔（0.7ml/只），待3-5天后腹水形成，取腹水離心后，生理鹽水稀釋為5×107/ml，于雌性KM小鼠（5-6周齡，15-17g）左后肢近背部皮下接種0.2ml。成瘤且腫瘤直徑>5mm進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：1、正常對照組（

4、未接種腫瘤，肌注生理鹽水1/日）2、腫瘤對照組（成瘤后，肌注生理鹽水1/日）；3、ART組（成瘤后，肌注青蒿琥酯20mg/kg/d）；4、DDP組（成瘤后，腹腔注射順鉑2mg/kg/d），各給藥0.2ml。每組80只，各組共給藥7日。后各組再次隨機(jī)分為4組，分別于第10d、20d、30d、40d處死，每組20只。
　　2.腫瘤組織中VEGF及COX-2表達(dá)情況及MVD計(jì)數(shù)的分析
　　制備腫瘤組織石蠟切片，免疫組化染色后進(jìn)行圖

5、像分析， VEGF、COX-2表達(dá)強(qiáng)度以灰度值（GS）表示，數(shù)值大小與陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度呈反比。以矩形走形計(jì)算200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各組陽性細(xì)胞表達(dá)百分率。
　　光鏡下VEGF染色陽性細(xì)胞呈棕黃色，采用weidner等方法進(jìn)行MVD量化分析。首先在低倍視野下掃視整個(gè)組織切片，在腫瘤浸潤區(qū)域選取內(nèi)皮細(xì)胞染色分析、微血管數(shù)量密集的視野，隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，對微血管數(shù)計(jì)算，計(jì)算平均值作為MVD。任何棕黃色陽性內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與臨近

6、腫瘤細(xì)胞、血管及其他結(jié)締組織分界清楚，即可作為1個(gè)微血管數(shù)；腫瘤硬化取和大于8個(gè)紅細(xì)胞的血管不做計(jì)數(shù)對象。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：對各組數(shù)據(jù)通過SPSS13.0版本軟件進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，對VEGF、COX-2表達(dá)情況及MVD計(jì)數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance, ANOVA），對于不符合正態(tài)性或方差齊性檢驗(yàn)者，采取K-independent samples秩和檢驗(yàn)，SNK法進(jìn)一步對多樣本均數(shù)進(jìn)行兩

7、兩比較。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠移植瘤中微血管生成情況
　　與腫瘤對照組移植瘤中MVD計(jì)數(shù)相比，DDP組及ART組均明顯減低(均P<0.05)。腫瘤組織中MVD計(jì)數(shù)呈腫瘤對照組>ART組>DDP組的總體趨勢。DDP組及ART組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），除在第20d時(shí) ART組腫瘤組織中 MVD計(jì)數(shù)較 DDP組明顯增高（21.23±2.71v.s16.69±2.44, P<0.05）。在腫瘤對照組、DDP組及

8、ART組中，各組MVD計(jì)數(shù)呈10d<20d<30d<40d的總體趨勢，除腫瘤對照組在10d及20d中無顯差異（20.59±2.52v.s22.72±2.97, P>0.05），ART組在20d及30d時(shí)無明顯差異（21.23±2.71v.s20.30±5.06, P>0.05），其余各組間均差異顯著（均P<0.05）。
　　2.ART對小鼠移植瘤中VEGF和COX-2表達(dá)的影響
　　2.1.對小鼠移植瘤中VEGF表達(dá)情況的影

9、響
　　與腫瘤對照組第10天VEGF陽性細(xì)胞百分率為（20.58％±3.28%）相比， DDP組明顯降低（14.89%±2.70%, P<0.05），ART組無明顯變化（17.95%±2.02%, P>0.05）。第20d、30d及40d時(shí)，移植瘤中VEGF陽性細(xì)胞百分率呈腫瘤對照組>ART組>DDP組的總體趨勢，除30d時(shí)，ART組與 DDP組之間無明顯差異外（38.54%±7.10%v.s31.67%±3.84%, P>0.0

10、5），其中各組之間均差異顯著（均P<0.05）。ART組、DDP組及腫瘤對照組中VEGF陽性細(xì)胞百分率均呈10d<20d<30d<40d的總體趨勢，除 DDP組在第10d和20d時(shí)無明顯差異外（14.89%±2.70%v.s17.41%±4.89%, P>0.05），其中各組之間均差異顯著（均P<0.05）。
　　在第10d及40d時(shí)，移植瘤中VEGF表達(dá)GS值在各組中無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P>0.05）。第20d和30d時(shí)，與腫瘤

11、對照組GS值（124.55±1.44,121.67±5.39）相比，ART組明顯降低（118.14±5.33，111.24±6.42, P<0.05）， DDP組在第20d時(shí)明顯回升（132.98±3.49，P<0.05），第30d時(shí)GS值略有降低(120.40±3.89, P>0.05)。
　　2.2.對小鼠移植瘤中COX-2表達(dá)情況
　　與腫瘤對照組第10天時(shí) COX-2陽性細(xì)胞百分率(34.10%±6.79%)相比，

12、DDP組明顯減低（16.92%±6.11%， P<0.05）， ART組無明顯變化（30.06%±5.28%，P>0.05）。在第20d、30d及40d時(shí)，移植瘤中COX-2陽性細(xì)胞百分率呈腫瘤對照組>ART組>DDP組的總體趨勢，除30d時(shí)， ART組與DDP組之間無明顯差異外（53.83%±5.54%v.s45.76%±11.83%， P>0.05），其余各組之間均差異顯著（均P<0.05）。ART組、DDP組及腫瘤對照組中COX-

13、2陽性細(xì)胞百分率均呈10d<20d<30d<40d的總體趨勢。除ART組在第10d、20d時(shí)（30.06%±5.28%v.s31.88%±6.72%, P>0.05），及DDP組在第10d、20d時(shí)（16.92%±6.11%v.s19.32%±6.03%, P>0.05）無明顯差異外，各組間均差異顯著（均P<0.05）。
　　與腫瘤對照組第10d時(shí)COX-2表達(dá)GS值(109.36±5.37)相比， DDP組明顯回升（118.67

14、±3.82, P<0.05），ART組無明顯變化（109.52±6.40, P>0.05）。在第20d、30d及40d時(shí)，移植瘤中COX-2陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度在ART組、DDP組及腫瘤對照組中無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）。
　　3.小鼠移植瘤中VEGF、COX-2表達(dá)及MVD相關(guān)性分析
　　小鼠腫瘤組織中VEGF及COX-2陽性細(xì)胞百分率在不同時(shí)間均呈正相關(guān)（10d:r=0.526, P<0.05;20d:r=0.599

15、, P<0.05;30d:r=0.859, P<0.05;40d:r=0.951, P<0.05）。VEGF陽性細(xì)胞百分率與MVD計(jì)數(shù)之間在不同時(shí)間均呈正相關(guān)（10d:r=0.773, P<0.05;20d:r=0.558, P<0.05;30d:r=0.804, P<0.05;40d:r=0.565, P<0.05）。COX-2陽性細(xì)胞百分率與MVD計(jì)數(shù)之間在除10d時(shí)均呈正相關(guān)（10d: r=0.339, P>0.05;20d: r

16、=0.615, P<0.05;30d: r=0.595, P<0.05;40d:r=0.563, P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.青蒿琥酯抑制小鼠 U14移植瘤生長可能與抑制腫瘤組織中 VEGF及COX-2的表達(dá)有關(guān)。
　　2.青蒿琥酯可顯著阻抑小鼠U14移植瘤中微血管生成，抑制腫瘤組織生長。
　　3.VEGF與 COX-2在腫瘤組織中表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系。COX-2及VEGF與腫瘤組織中微血管生成具有相關(guān)性