青蒿琥酯對(duì)宮頸癌U14細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)增殖及移植瘤小鼠外周免疫抑制分子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：目前宮頸癌發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第二位，發(fā)病年齡逐年降低，嚴(yán)重危害女性身心健康。宮頸癌的治療模式仍以手術(shù)為主，放化療為輔。但手術(shù)創(chuàng)傷大，放化療不良反應(yīng)明顯，且均可進(jìn)一步損傷機(jī)體免疫功能。為此，尋找既能殺傷宮頸癌細(xì)胞又對(duì)患者免疫功能無加重?fù)p害的治療方法已成為研究關(guān)注點(diǎn)。青蒿琥酯是一種公認(rèn)的抗瘧類藥物，但研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌等均具有明顯的多靶點(diǎn)抗瘤活性。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析青蒿琥酯（ART）對(duì)小鼠宮頸癌 U

2、14細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及移植瘤小鼠免疫功能的影響，從抑制 U14細(xì)胞增殖及逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制的角度探討青蒿琥酯的抗宮頸癌作用機(jī)制，為其在臨床廣泛應(yīng)用提供相應(yīng)理論支持。
　　方法：
　　1 MTT法分析ART對(duì)U14細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響：U14細(xì)胞以不同的細(xì)胞濃度（2.5×104/mL、2×105/mL、1.0×106/mL）進(jìn)行培養(yǎng)，采用MTT法測(cè)定培養(yǎng)不同時(shí)間（12h、24h、36h、48h、60h、72h）后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的 A

3、492值，確定 U14細(xì)胞最佳接種濃度及培養(yǎng)時(shí)間。以確定的接種濃度及培養(yǎng)時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)不同濃度（4.69ug/mL-600ug/mL）青蒿琥酯對(duì)U14細(xì)胞體外增殖的抑制作用，并計(jì)算相對(duì)抑制率。
　　2 U14移植瘤小鼠動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組：以5×107/mL U14細(xì)胞懸液，接種于小鼠左后肢近背部皮下（0.2mL/只）制備小鼠移植瘤模型。成瘤且瘤直徑>5mm的小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將造模成功的移植瘤小鼠隨機(jī)分為3組：1、腫

4、瘤對(duì)照組；2、ART治療組；3、順鉑（DDP）對(duì)照組，每組80只。同時(shí)設(shè)立同周齡健康的無移植瘤小鼠作為正常對(duì)照組。連續(xù)治療7日后，各組再隨機(jī)分為4組，每組20只，分別于第10d、20d、30d、40d處死。
　　3給藥方法：小鼠腫瘤直徑>5mm時(shí)開始給藥，共治療7d。根據(jù)人體使用劑量換算，ART治療組小鼠肌肉注射ART（20mg/kg/d，0.2mL/次）；DDP對(duì)照組小鼠腹腔注射順鉑（2mg/kg/d，0.2mL/次）；腫瘤對(duì)照

5、組及正常對(duì)照組小鼠給予等量的0.9％生理鹽水肌注。
　　4小鼠移植瘤生長(zhǎng)狀況觀察：從接種腫瘤細(xì)胞之日起每日觀察小鼠一般情況（精神、飲食、體重、活動(dòng)、毛發(fā)、皮膚等）及移植瘤生長(zhǎng)情況。每10d測(cè)小鼠體重、移植瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑，計(jì)算腫瘤體積；處死日剝瘤稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。觀察各組小鼠存活天數(shù)，并計(jì)算生命延長(zhǎng)率。
　　5 MTT法檢測(cè)脾T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化：小鼠處死日無菌取脾稱量脾重，計(jì)算脾指數(shù)，行小鼠脾T淋巴細(xì)胞ConA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

6、實(shí)驗(yàn)，計(jì)算T淋巴細(xì)胞體外刺激指數(shù)SI。
　　6 ELISA法測(cè)定小鼠血清免疫抑制分子表達(dá)：小鼠處死日當(dāng)天收集血清，嚴(yán)格按ELISA試劑盒操作，檢測(cè)各組小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量。
　　結(jié)果：
　　1 U14細(xì)胞培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時(shí)間的確定
　　初始培養(yǎng)濃度為2×105/mL時(shí)，生長(zhǎng)增殖曲線良好而穩(wěn)定，于36h完全覆蓋瓶底，48h后培養(yǎng)液開始變黃，pH值逐漸降低，確定此初始濃度

7、下培養(yǎng)36h為最佳培養(yǎng)條件。
　　2 ART對(duì)U14細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖的影響
　　與未經(jīng)ART作用的腫瘤細(xì)胞對(duì)照組A492值（0.913±0.265）相比，濃度在37.5ug/mL-600ug/mL之間的ART作用后可使U14細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的A492值呈漸進(jìn)性顯著降低（分別為0.688±0.097、0.678±0.172、0.519±0.086、0.418±0.062、0.063±0.039，均P<0.05），相對(duì)抑制率呈遞進(jìn)性

8、升高（分別為24.64%、25.74%、43.15%、54.22%、93.10%）。而當(dāng)ART作用濃度≤18.75ug/mL時(shí)，A492值與未經(jīng)ART作用的腫瘤細(xì)胞對(duì)照組相比無明顯差異。相關(guān)性分析顯示，ART作用濃度與 A492值之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.971，P=0.000），與相對(duì)抑制率之間呈顯著正相關(guān)（r=0.988， P=0.000）。
　　3 ART對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)狀況的影響
　　小鼠皮下接種U14細(xì)胞3-5天

9、后成瘤，成瘤率100%。局部皮膚于接種后10d內(nèi)呈破潰、流膿等明顯的炎癥反應(yīng)。腫瘤對(duì)照組小鼠精神萎靡，進(jìn)食量少、睡眠較差，晚期呈消瘦狀態(tài)，體重與正常對(duì)照組相比顯著下降（均P<0.05）。DDP對(duì)照組小鼠反應(yīng)差，毛發(fā)晦暗無光澤，食欲差，排便、排尿次數(shù)少，呈消瘦狀態(tài)，體重與正常對(duì)照組相比顯著下降（均P<0.05）,且與腫瘤對(duì)照組相比10d組體重顯著降低（P<0.05），20d、30d、40d組相比均無明顯差異。ART治療組小鼠精神、飲食、睡

10、眠等均較正常對(duì)照組小鼠無顯著差異，各時(shí)間段小鼠體重較腫瘤對(duì)照組及DDP對(duì)照組均有顯著回升（均 P<0.05），與正常對(duì)照組小鼠相比20d、40d組體重顯著降低（均P<0.05），10d、30d組體重?zé)o明顯改變。各組小鼠體重大致呈現(xiàn)為DDP對(duì)照組<腫瘤對(duì)照組　　與腫瘤對(duì)照組相比，各時(shí)間段內(nèi)兩治療組小鼠瘤體積有下降趨勢(shì)， DDP對(duì)照組小鼠在第10d時(shí)瘤體積明顯低于腫瘤對(duì)照組（P<0.05），其他

11、時(shí)間段比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；DDP對(duì)照組小鼠瘤體積較ART治療組下降明顯，但差異不顯著。與腫瘤對(duì)照組小鼠各時(shí)間段瘤重相比，兩治療組均較其明顯下降（均P<0.05），DDP對(duì)照組瘤重于第10d明顯低于ART治療組（P<0.05）。瘤體積、瘤重呈現(xiàn)為 DDP對(duì)照組　　ART治療組及DDP對(duì)照組小鼠生存時(shí)間與腫瘤對(duì)照組小鼠（38.0±2.79）d相

12、比，均明顯延長(zhǎng)（均 P<0.05）；ART治療組生存時(shí)間（44.8±3.25）d較DDP對(duì)照組（47.3±3.89）d偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。小鼠生命延長(zhǎng)率DDP對(duì)照組（24.47%）高于ART治療組（17.89%）。
　　4 ART對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)增殖的影響
　　腫瘤對(duì)照組及兩治療組脾指數(shù)隨時(shí)間推移均有降低趨勢(shì)。腫瘤對(duì)照組小鼠在第10d時(shí)脾指數(shù)較正常對(duì)照組明顯增高（P<0.05），其他時(shí)間點(diǎn)均有不同程度

13、降低，但與正常對(duì)照組相比差異不顯著（均P>0.05）。DDP對(duì)照組在第10d脾指數(shù)較正常對(duì)照組明顯升高（P<0.05），在第40d時(shí)值較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.05），在20d、30d與正常對(duì)照組相比無差異；其各時(shí)間段值與腫瘤對(duì)照組相比均有所降低，在第40d時(shí)兩組相比有明顯差異（P<0.05）。ART治療組從第20d開始脾指數(shù)較 DDP對(duì)照組有一明顯回升（P<0.05），且在第20d時(shí)顯著高于腫瘤對(duì)照組（P<0.05），在第10d、

14、20d時(shí)較正常對(duì)照組顯著增高（P<0.05）。自20d后脾指數(shù)值呈現(xiàn)為DDP對(duì)照組<腫瘤對(duì)照組<正常對(duì)照組　　腫瘤對(duì)照組及DDP對(duì)照組第20d、30d、40d的T淋巴細(xì)胞體外刺激指數(shù) SI明顯低于正常對(duì)照組（均 P<0.05），DDP對(duì)照組第10d、20d的SI值明顯低于腫瘤對(duì)照組（均 P<0.05）。ART治療組第20d、30d、40d的SI值較腫瘤對(duì)照組明顯回升（均P<0.05）；第10d、20d、

15、40d時(shí)與DDP對(duì)照組相比SI也明顯回升（均P<0.05）；第30d時(shí)SI值較正常對(duì)照組明顯降低（P<0.05），其他時(shí)間段兩組比較均無差異（均 P>0.05）。自20d起SI值大致呈現(xiàn)為DDP對(duì)照組<腫瘤對(duì)照組　　5 ART對(duì)小鼠血清免疫抑制分子表達(dá)的影響
　　與正常小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、PGE2含量相比，腫瘤對(duì)照組及兩治療組中各時(shí)間段內(nèi)上述含量均明

16、顯升高（ P<0.05）。經(jīng)ART、DDP治療后的小鼠血清中 IL-4、IL-6含量與腫瘤對(duì)照組相比無明顯差別（均P>0.05）。DDP對(duì)照組與腫瘤對(duì)照組相比，IL-10含量無明顯差異；ART治療后，小鼠血清中IL-10含量較腫瘤對(duì)照組及DDP對(duì)照組明顯降低（均 P<0.05）。兩治療組小鼠血清中 TGF-β1、PGE2含量與腫瘤對(duì)照組相比較均明顯降低（均P<0.05），且ART治療組中TGF-β1、PGE2含量均低于DDP對(duì)照組（均P

17、<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 ART有抑制宮頸癌U14細(xì)胞體內(nèi)外增殖的作用，且隨著ART作用濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。
　　2 ART可通過增強(qiáng)U14荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞功能發(fā)揮抗瘤活性。
　　3 ART通過下調(diào)U14荷瘤小鼠血清中IL-10、TGF-β1、PGE2分泌而有效逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制，從而發(fā)揮針對(duì)宮頸癌的抗瘤活性。
　　4 ART及DDP對(duì)U14移植瘤生長(zhǎng)均有抑制作用，但ART對(duì)T淋巴細(xì)胞功