支氣管哮喘microRNA表達(dá)譜差異分析及沙美特羅藥物干預(yù)對(duì)其影響.pdf

1、目前我國(guó)的哮喘患者有3千萬(wàn)左右，2010年的CARE研究中，中國(guó)8個(gè)省市14歲以上調(diào)查人群的患病率為1.24％，受全球工業(yè)化和城市化的進(jìn)程、環(huán)境污染及氣候變化等因素的影響，哮喘患病率有增加的趨勢(shì)。
　　哮喘是一種慢性呼吸道疾病，需要長(zhǎng)期用藥控制，疾病負(fù)擔(dān)既表現(xiàn)為勞動(dòng)力喪失導(dǎo)致的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加，也表現(xiàn)為對(duì)衛(wèi)生資源的消耗。因此，研究哮喘發(fā)病機(jī)制的廣度和深度不斷增加，對(duì)與預(yù)防和治療支氣管哮喘有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　miRNA是

2、一種內(nèi)源性的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸，不編碼蛋白質(zhì)，在體內(nèi)成熟后，通過(guò)結(jié)合RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA通過(guò)靶向mRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控作用。miRNA參與各種基本生物學(xué)過(guò)程，miRNA失調(diào)可導(dǎo)致機(jī)體的病理狀態(tài)。miRNA在肺部發(fā)育及肺部疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化和肺動(dòng)脈高壓中的作用近年來(lái)也逐漸開(kāi)始有研究

3、涉及。
　　炎癥反應(yīng)是哮喘發(fā)展中的重要病理過(guò)程，miRNA通過(guò)靶向免疫受體和細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥。在不斷的深入研究中，miRNA在哮喘中的作用及機(jī)制越來(lái)越為人們所了解，有可能在將來(lái)成為哮喘診斷和預(yù)后評(píng)估的輔助手段以及治療的新靶點(diǎn)，為哮喘診治帶來(lái)新的希望。
　　目的:
　　篩選哮喘發(fā)病及沙美特羅藥物治療相關(guān)miRNA，探討其在哮喘臨床診治中的作用。
　　方法:
　　1、構(gòu)建急性哮喘小鼠模型，利用mi

4、RNA芯片檢測(cè)其肺組織miRNA表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)聚類分析、靶基因預(yù)測(cè)、GO和Pathway分析，篩選出疾病相關(guān)miRNA，并通過(guò)RT-PCR法驗(yàn)證明顯表達(dá)差異的miRNA。收集對(duì)照組和哮喘組患者血清，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)外周血miRNA表達(dá)水平。
　　2、在篩選出與哮喘密切相關(guān)的miRNA后，復(fù)制急性哮喘小鼠模型，采用沙美特羅藥物干預(yù)，評(píng)估模型綜合狀況，然后，利用miRNA芯片技術(shù)分析藥物干預(yù)對(duì)miRNA表達(dá)譜的變

5、化的影響，進(jìn)行芯片表達(dá)譜差異分析和趨勢(shì)分析，篩選出與沙美特羅藥物治療相關(guān)的miRNA;并通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1、建立急性哮喘小鼠模型，從一般狀況觀察、肺功能氣道反應(yīng)性測(cè)定、病理學(xué)炎癥改變、粘液分泌狀況、灌洗液細(xì)胞分類檢測(cè)以及血清和灌洗液IgE含量檢測(cè)方面全面評(píng)估了模型構(gòu)建情況，確認(rèn)模型構(gòu)建成功。
　　2、哮喘模型組與對(duì)照組間有854個(gè)差異miRNA，其中155個(gè)有顯著差異，差異倍數(shù)≥2的m

6、iRNA有48個(gè)，其中下調(diào)最明顯的是miR-208a-5p，下調(diào)6.41倍。通過(guò)TargetScan、miRanda兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交集，預(yù)測(cè)候選靶基因8689個(gè)，優(yōu)化靶基因范圍至940個(gè)，進(jìn)行GO及KEGG分析，得到118條基因注釋和43條信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、趨化因子信號(hào)通路、炎癥細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞粘附、內(nèi)皮組織增生、血管平滑肌收縮等生物過(guò)程，其中大部分都與哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程相關(guān)。接下來(lái)對(duì)6個(gè)表達(dá)差異顯著的miR

7、NA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明miR-208a-5p、miR-133a-3p、miR-486-3p、miR-193b-3p、miR-205-5p的表達(dá)差異與miRNA芯片數(shù)據(jù)一致，miR-92a-2-5p在模型組型組較對(duì)照組有上調(diào)趨勢(shì)，與芯片數(shù)據(jù)趨勢(shì)一致，證實(shí)了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。
　　3、檢測(cè)哮喘患者的外周血清中miR-208a-5p、miR-133a-3p二者表達(dá)水平，結(jié)果表明兩個(gè)miRNA在臨床標(biāo)本中異常下調(diào)表達(dá)，有望作為哮喘臨床診斷

8、的輔助指標(biāo)。
　　4、對(duì)沙美特羅藥物干預(yù)后的哮喘模型小鼠miRNA芯片表達(dá)譜分析，通過(guò)篩選差異基因及趨勢(shì)分析，我們發(fā)現(xiàn)，與哮喘組異常表達(dá)的miRNA相比，沙美特羅藥物干預(yù)后有233個(gè)miRNA的表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，分析表達(dá)差異倍數(shù)為1.5，P＜0.05，得到3個(gè)用藥相關(guān)miRNA:miR-1291、miR-205-5p、miR-142-5p，行RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證其中兩個(gè)miRNA即miR-1291和miR-205-5p在哮喘小鼠肺組

9、織中表達(dá)水平下降，在沙美特羅藥物干預(yù)組中表達(dá)水平增加，接近對(duì)照組，表明miR-1291、miR-205-5p參與了沙美特羅治療哮喘的病理生理過(guò)程。
　　5、應(yīng)用屋塵螨(Der p2)刺激氣道上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用miR-1291mimics可以增加Der p2刺激后的氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的miR-1291的含量，并抑制黏液的合成。
　　結(jié)論:
　　1、成功復(fù)制急性哮喘模型，而沙美特羅對(duì)其進(jìn)行有效干預(yù)。
　　2、成功建

10、立急性哮喘小鼠模型miRNA表達(dá)譜，并通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)哮喘模型差異表達(dá)的miRNA參與了哮喘發(fā)病的多個(gè)重要生物學(xué)過(guò)程，影響其中多條重要信號(hào)通路，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要調(diào)控作用。
　　3、通過(guò)miRNA表達(dá)譜分析及RT-PCR驗(yàn)證，證實(shí)miR-208a-5p、miR-133a-3p、miR-486-3p、miR-193b-3p、miR-205-5p在哮喘小鼠肺組織顯著差異表達(dá)。
　　4、哮喘患者外周血清miR-

11、208a-5p、miR-133a-3p表達(dá)下降，聯(lián)合檢測(cè)外周血清二者的表達(dá)水平，可能成為哮喘早期診斷新的輔助分子標(biāo)志物。
　　5、采用沙美特羅干預(yù)哮喘小鼠后，對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行miRNA芯片表達(dá)譜的差異分析，得到3個(gè)與藥物干預(yù)密切相關(guān)的miRNA，并經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證其中兩個(gè)miRNA（miR-1291、miR-205-5p）在哮喘小鼠肺組織中表達(dá)水平下降，在沙美特羅藥物干預(yù)組中表達(dá)水平增加，接近對(duì)照組，提示其參與沙美特羅治療