表達(dá)牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白重組干酪乳桿菌的構(gòu)建、免疫原性評(píng)價(jià)及其抗原捕獲ELISA方法的建立.pdf

1、牛病毒性腹瀉(BVD)由是牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的能?chē)?yán)重影響牛群的健康狀態(tài)和生產(chǎn)情況,可引起持續(xù)的經(jīng)濟(jì)損失,是全球最重要的牛傳染病之一。BVDV為黃病毒科瘟病毒屬成員,其致病機(jī)制獨(dú)特且能引起免疫抑制,常導(dǎo)致該病防控失敗。正確的免疫程序、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和清除持續(xù)感染動(dòng)物等措施對(duì)于持續(xù)有效地防控該病十分重要。本研究構(gòu)建了表達(dá)BVDV E2蛋白的重組干酪乳桿菌（L.casei）

2、評(píng)估了其免疫原性,研究了干酪乳桿菌的抑制病毒增殖能力,同時(shí)還建立檢測(cè)BVDV抗原的ELISA方法,為該病的預(yù)防與控制提供技術(shù)支持。
　　1、表達(dá)BVDV囊膜糖蛋白E2重組干酪乳酸桿菌（L.casei/pELX1-E2）的構(gòu)建和免疫原性評(píng)價(jià)
　　1.1、重組干酪乳酸桿菌（L.casei/pELX1-E2）的構(gòu)建
　　BVDVE2蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體,同時(shí)L.casei在腹瀉病的防控中被廣泛使用,常被用作異

3、源基因表達(dá)載體。本研究首先通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增BVDV(NADL-AV67)的E2基因,將其克隆至pELX1載體,構(gòu)建重組載體pELX1-E2。將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,通過(guò)SDS-PAGE和Western blot(WB)驗(yàn)證E2蛋白的表達(dá)。將重組載體pELX1-E2電轉(zhuǎn)到L.casei感受態(tài)細(xì)胞中,得到重組菌株L.casei/pELX1-E2。通過(guò)SDS-PAGE和WB證實(shí)重組L.casei/pELX1-E

4、2能成功表達(dá)E2蛋白。表達(dá)產(chǎn)物大小約為40kDa,且當(dāng)菌液OD600值達(dá)到1.5時(shí)表達(dá)量最高。通過(guò)間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)證實(shí)E2蛋白表達(dá)于重組細(xì)菌的表面。
　　1.2、用BALB/c小鼠評(píng)估疫苗株免疫原性。
　　將小鼠隨機(jī)分成5組,其中3組分別通過(guò)口服、鼻內(nèi)和肌內(nèi)注射等途徑免疫等量的(1010CFU/mL)重組干酪乳桿菌（L.casei/pELX1-E2）,另外2組分別口服含空質(zhì)粒的干酪乳桿菌(L.casei/pELX1

5、)和無(wú)菌PBS。兩周后加強(qiáng)免疫,共免疫三次。在免疫后0、14、28、42天,尾靜脈采血,檢測(cè)IgG、IFN-γ和IL-12水平,收集糞便檢測(cè)sIgA水平以評(píng)估黏膜免疫水平。使用105TCID50劑量的BVDV-1株攻擊免疫鼠以評(píng)估疫苗的保護(hù)效力。與肌肉注射L.casei/pELX1-E2相比,口服或者鼻內(nèi)注射L.casei/pELX1-E2能顯著(P＜0.01)提高黏膜sIgA、血清IgG、IFN-γ和IL-12水平,其中鼻內(nèi)接種免疫效

6、果最好。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,該疫苗株能產(chǎn)生針對(duì)BVDV的中和抗體,效價(jià)為1∶128。由此可見(jiàn),L.casei/pELX1-E2可以作為一種安全、有效的預(yù)防BVD的候選疫苗。
　　2、L.caseiMCJ蛋白質(zhì)代謝物(LPM)抑制BVDV-1感染MDBK細(xì)胞的研究。
　　乳酸桿菌被廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物胃腸疾病的預(yù)防和治療。本試驗(yàn)使用MDBK細(xì)胞模型,研究LPM體外抗BVDV的作用。首先從L.casei培養(yǎng)液中提取其安全性和活性好的

7、LPM;其次,測(cè)定了LPM對(duì)細(xì)胞的毒性,當(dāng)LMP濃度達(dá)到3000μg/ml細(xì)胞活性仍高于80％,說(shuō)明LPM的細(xì)胞毒性較小?？瞻咴囼?yàn)結(jié)果證明LPM可以有效抑制BVDV感染。為了研究LPM的抗病毒機(jī)制,分別在BVDV-1病毒感染前、感染時(shí)和感染后用LPM處理MDBK細(xì)胞。間接免疫熒光試驗(yàn)、定量RT-PCR和WB結(jié)果顯示,經(jīng)LPM處理后BVDV感染細(xì)胞的數(shù)量、病毒的拷貝數(shù)以及BVDV E2蛋白的表達(dá)量顯著減少,在三種處理中,在BVDV感染的同

8、時(shí)加入LPM抑制效果最好。本研究證明LPM具有潛在的抗BVDV作用。
　　3、BVDV抗原檢測(cè)夾心ELISA方法的建立
　　3.1、重組蛋白的表達(dá)、單克隆抗體和多克隆抗體的制備。
　　首先將BVDV的NS3和E2基因分別克隆到pET-30a(+),使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)NS3和E2蛋白。將純化的E2蛋白免疫四周齡BALB/c小鼠（n=5）。間接ELISA結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞（IB-10）產(chǎn)生的抗體可識(shí)別與E2蛋白和BVDV

9、-1抗原,其效價(jià)為1∶12800。純化用雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠的腹水,獲得E2蛋白的單克隆抗體。使用純化的NS3蛋白免疫10周齡新西蘭白兔制備針對(duì)NS3蛋白的多克隆抗體(PAb)。采用間接ELISA、WB和IFA試驗(yàn)鑒定MAb和PAb。
　　3.2、抗原捕獲ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化。
　　使用棋盤(pán)滴定法確定能產(chǎn)生最高P/N值的反應(yīng)條件。以兔抗NS3多克隆抗體為捕獲抗體、鼠抗E2單克隆抗體為檢測(cè)抗體。檢測(cè)了25份BVDV陰性白細(xì)胞

10、樣品,根據(jù)平均OD值確定該方法的判定標(biāo)準(zhǔn)是OD值0.523。該ELISA可檢測(cè)最低濃度為50ng/mL的BVDV蛋白的和103TCID50的病毒量。批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為3.87％和6.90％。本AC-ELISA方法可以有效區(qū)分BVDV與引起牛和豬腹瀉的其他病原,無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。
　　3.3、模擬陽(yáng)性樣品的檢測(cè)。
　　將BVDV人為加入白細(xì)胞樣品、皮膚和肺樣品中,用本方法、TaqMan qRT-PCR和傳統(tǒng)RT-PCR同時(shí)檢

11、測(cè)計(jì)算Kappa值。本方法與這兩種方法之間的Kappa值為0.86,1.0;0.86,0.72和0.72,0.85,檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性。表明一種敏感性和特異性較好的BVDV-1的抗原捕獲ELISA方法已經(jīng)建立,但還需要進(jìn)一步的臨床評(píng)價(jià)。
　　結(jié)論:本研究用小鼠模型評(píng)估了表達(dá)BVDV E2蛋白的重組干酪乳桿菌的免疫原性,結(jié)果表明該重組菌有成為新的抗BVDV疫苗的潛力;發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌在體外具有抗BVDV的活性,表明干酪乳桿菌在預(yù)防