表達(dá)西尼羅病毒囊膜糖蛋白prM-E重組新城疫病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、西尼羅熱(West Nile Fever，WNF)是一種由西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)引起的具有嚴(yán)重威脅的外來(lái)人畜共患病。人和動(dòng)物在感染W(wǎng)NV后會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、腦膜炎、腦炎等癥狀，甚至引起死亡，因此該病毒在全球范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。西尼羅熱曾于2012年在美國(guó)爆發(fā)，引起了118人死亡，目前，我國(guó)未報(bào)道有WNF的臨床病例，但是我國(guó)自然地理環(huán)境復(fù)雜多樣，存在蚊蟲(chóng)媒介繁殖和鳥(niǎo)類遷徙的天然條件，應(yīng)提早引起重視，因此WNV在

2、我國(guó)出入境監(jiān)督防預(yù)系統(tǒng)中有重要的研究?jī)r(jià)值。
　　WNV屬于黃病毒科、黃病毒屬、日本腦炎血清群，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。WNV的結(jié)構(gòu)蛋白包括C(capsid)蛋白、E(envelope)蛋白和M(membrane)蛋白。E蛋白是WNV表面最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其表面的抗原決定簇與中和活性、組織嗜性、血清特異性、病毒的毒力、宿主范圍有關(guān)。新城疫病毒(Newcastle Disease virus，NDV)的低致病性毒株LaSota株

3、對(duì)哺乳動(dòng)物不能產(chǎn)生有效感染，只在禽源組織中復(fù)制，并且具有外源蛋白表達(dá)效率高與生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。以NDV為載體的重組疫苗其安全性和有效性在豬、犬、貓、非洲綠猴等多種動(dòng)物得到證明。NDV活載體疫苗可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生粘膜、體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　目前，我國(guó)雖沒(méi)有WNV感染的病例報(bào)道，但鑒于該病毒傳入我國(guó)的高風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)人類極強(qiáng)的感染力和致病力，安全有效的儲(chǔ)備性疫苗的研制開(kāi)發(fā)顯得尤為重要。從近幾年的WNV感染流行情況來(lái)看，流行范圍正在趨

4、于全球化，而且發(fā)生神經(jīng)癥狀的比例顯著增加，世界各國(guó)針對(duì)WNV研制的疫苗在實(shí)際應(yīng)用中相繼出現(xiàn)了各種問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室建立起的新城疫病毒反向遺傳學(xué)操作平臺(tái)，成功構(gòu)建并獲得表達(dá)H5亞型禽流感病毒保護(hù)性HA蛋白的重組NDV、表達(dá)狂犬病毒囊膜糖蛋白的重組NDV、分別表達(dá)尼帕病毒G蛋白和F蛋白的重組NDV等，這些重組病毒的安全性和有效性已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和本體動(dòng)物上獲得驗(yàn)證，繼而表明NDV作為活病毒疫苗載體具有極大的優(yōu)勢(shì)，同樣也是對(duì)于構(gòu)建新型疫苗防治人類和

5、哺乳動(dòng)物疾病是非常有前景的載體。
　　本研究利用反向遺傳操作系統(tǒng)，將人工合成的WNVprM和E基因與新城疫病毒LaSota疫苗株毒重組，拯救得到表達(dá)WNV prM和E蛋白的重組病毒rLa-WNV-prM/E，并在6周齡雌性C57BL/6小鼠上對(duì)其安全性和免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。RT-PCR、間接免疫熒光和激光共聚焦等試驗(yàn)證明WNVprM和E基因能夠正確插入和表達(dá);對(duì)雞胚、小鼠和雞的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明重組病毒rLa-WNV-prM/E沒(méi)有增

6、強(qiáng)載體病毒NDV LaSota疫苗株對(duì)小鼠和雞的致病力，具有良好生物安全性;利用Elisa、蝕斑減少中和試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)檢測(cè)重組病毒rLa-WNV-prM/E接種C57BL/6小鼠后誘導(dǎo)其產(chǎn)生的顯著的特異性IgG、中和抗體、CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，說(shuō)明rLa-WNV-prM/E能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗WNV prM/E的特異性體液免疫和特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究表明重組病毒rLa-WNV-prM/E作為防控WNV的儲(chǔ)備