豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)及其免疫原性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，也可引起豬皮炎腎病綜合征(PNDS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)及腸炎和繁殖障礙等。多年來(lái)PCV2在我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)中已廣泛存在，成為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三大疫病之一，也是全球公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)

2、濟(jì)損失。PCV2含有2個(gè)功能性的開(kāi)放閱讀框(ORF)，即ORF1編碼的與病毒滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，ORF2編碼的核衣殼（Cap）蛋白。ORF2編碼的核衣殼(Cap)蛋白是病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，是作為基因工程亞單位疫苗和血清學(xué)診斷研究的首選基因。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)將PCV2 ORF2基因克隆至原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中，制備獲得了具有生物學(xué)活性的重組Cap蛋白，并進(jìn)行了免疫原性研究。具體實(shí)驗(yàn)和結(jié)

3、果如下:
　　 1.為了提高PCV2 Cap蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人工合成的方法將ORF2基因的密碼子改造為大腸桿菌嗜好的密碼子，以改造后合成的PCV2ORF2基因?yàn)槟０?，參照合成序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并在其上下游引物5'端分別引入BamHⅠ，HindⅢ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)ORF2基因，PCR回收產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切處理的PET-32a表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定后提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)

4、化Rosetta表達(dá)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)，且通過(guò)密碼子優(yōu)化目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中，純化后測(cè)得蛋白濃度為998ug/mL。Western Blot分析表明獲得的重組蛋白能被PCV2多克隆陽(yáng)性血清所識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。用純化后的目的蛋白免疫新西蘭白兔，制備出針對(duì)Cap蛋白的兔多克隆抗體。
　　 2.為了探索利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to

5、-Bac expression system)分泌表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白作為亞單位疫苗的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)將PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信號(hào)肽(Melittin)的轉(zhuǎn)移栽體pFastBacⅠ中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒(pFastBAC-Cap)轉(zhuǎn)化至DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性及藍(lán)白斑篩選得到含Cap基因的重組桿狀病毒DNA(Bacmid-Cap)，用Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑將提取的Bacmid-Cap轉(zhuǎn)染至s

6、f9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒(rBac-Cap)，應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)的High Five細(xì)胞進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化。重組蛋白通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)證明:在重組桿狀病毒感染的High Five昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得分泌表達(dá)，并可產(chǎn)生較高濃度的重組蛋白;Western Blot結(jié)果顯示:重組蛋白可被豬PCV2的特異性抗體所識(shí)別，表明重組蛋白具有免疫學(xué)反應(yīng)性;應(yīng)用重組蛋白免疫BALB/C小鼠試驗(yàn)結(jié)果顯示:該蛋白可刺激小鼠產(chǎn)