雷帕霉素通過Ets1促進Foxp3穩(wěn)定表達的研究.pdf

1、分類號：R3929密級：內(nèi)部2年學位類別：科學學位團專業(yè)學位口學校代碼：10062學號：20092048學科門類：醫(yī)學夭肄醬斜文等TlANJIN黼鍪O|‘滿毛堪麓I媛囂渤1髻碩士學位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目：雷帕霉素通過Etsl促進Foxp3穩(wěn)定表達的研究TITLERapamycinenhacethestabilizedexpressionofFoxp3viaEtsl一級學科：基礎醫(yī)學二級學科：免疫學論文作者

2、：趙輝指導教師：姚智教授天津醫(yī)科大學研究生院二。一二年五月天津醫(yī)科大學碩士學位論文中文摘要目的使用RAPA／TGF6誘導CD4Foxp3。T細胞表達Foxp3蛋白，使其轉(zhuǎn)化為iTreg細胞，檢測Foxp3基因組相關DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，進一步檢測甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化相關蛋白的變化，初步探討RAPA發(fā)揮作用的可能機制。方法I磁珠分離與流式分選法獲取Foxp3GFPBALB／C轉(zhuǎn)基因鼠CD4Foxp3‘T細胞，以RAPA／TGFD共同誘

3、導CD4Foxp3。T細胞表達Foxp3蛋白，轉(zhuǎn)化為iTreg細胞，流式細胞術檢測iTreg細胞的誘導效率和Foxp3蛋白表達穩(wěn)定性。2流式分選iTreg細胞，提取基因組DNA，經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，用甲基化特異性引物進行PCR擴增。將特異的擴增產(chǎn)物連接到TA克隆載體，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌進行擴增，然后進行基因測序，以檢測Foxp3基因相關DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)。3應用RealTimePCR和WesternBlot技術檢測iTreg細胞

4、的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b等甲基化酶以及Etsl和TDG等去甲基化相關蛋白的改變。結(jié)果1TGFp可以誘導CD4Foxp3’T細胞表達Foxp3蛋白，使其轉(zhuǎn)化為iTreg，其中10ng／ml誘導至第3天效率最高，F(xiàn)oxp3陽性率可達177％，隨著時間延長，F(xiàn)oxp3陽性率逐漸降低，至第10天，僅有不到10％。這表明TGFp誘導產(chǎn)生的iTreg細胞不能穩(wěn)定表達Foxp3蛋白。RAPA／TGF13可明顯促進Foxp3蛋白的表達，

5、與TGFp誘導法相比，各個時間點誘導效率均顯著提高(P005)。其中，RAPA／TGFp在第7天的誘導效率最高，可達309％。從第5天至第10天，RAPA／TGF—p誘導iTreg產(chǎn)率相對穩(wěn)定，均高于20％，直到第10天仍有265％表達率，表明RAPA／TGFB可以使Foxp3蛋白相對穩(wěn)定表達。2測序結(jié)果顯示，E1BSP和E2BSP引物對應基因組DNA區(qū)域各組細胞均為去甲基化狀態(tài)。TSDRBSP引物對應基因組DNA區(qū)域存在6個CpG位點