FoxP3在胃癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　以往認(rèn)為FoxP3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)Treg的形成和功能發(fā)揮起關(guān)鍵作用。在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等多種腫瘤中，Treg與臨床病理特征及預(yù)后評(píng)價(jià)有重要關(guān)系。目前發(fā)現(xiàn)FoxP3也在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，具有重要的臨床意義。然而，關(guān)于這兩種均表達(dá)FoxP3的淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間有無(wú)相互作用及其作用方式和機(jī)制還不清楚。僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道了腫瘤細(xì)胞可以促進(jìn)CD4+T轉(zhuǎn)變Treg，發(fā)揮免疫逃

2、逸作用。FoxP3基因的功能作用仍不清楚，特別是在胃癌中研究還比較少，它對(duì)胃癌生物學(xué)行為影響還不明確。僅有少量研究發(fā)現(xiàn)FoxP3在乳腺癌和前列腺癌中能抑制多種癌基因的轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究的目的是檢測(cè)和分析在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中FoxP3在胃癌細(xì)胞以及浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義，研究胃癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞作用方式和機(jī)制，探討FoxP3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響及發(fā)揮作用可能的信號(hào)通路，以闡述FoxP3在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作

3、用及分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.利用Real-time PCR和免疫組化技術(shù)檢測(cè)了FoxP3在癌前病變和胃癌組織中的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)FoxP3蛋白在多種胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)及分布情況。用免疫組化技術(shù)檢測(cè)胃癌組織芯片中胃癌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中FoxP3蛋白的表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)分析了胃癌組織及組織芯片中腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞FoxP3陽(yáng)性表達(dá)分別與臨床病理特征的關(guān)系;用生存曲線及Cox回歸分析兩種細(xì)胞中Fox

4、P3對(duì)預(yù)后評(píng)價(jià)的意義。
　　2.建立直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)體系來(lái)模擬腫瘤微環(huán)境。活細(xì)胞工作站及MTT法檢測(cè)兩種共培養(yǎng)體系下對(duì)胃癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞增殖的影響。Real-time PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后胃癌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中FoxP3及相關(guān)分子表達(dá)變化。ELISA技術(shù)檢測(cè)不同共培養(yǎng)方式下細(xì)胞上清液中TGF-β1和TGF-β2細(xì)胞因子分泌情況。
　　3.體外，用shRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，經(jīng)藥物篩選和單

5、克隆挑選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染FoxP3基因后胃癌細(xì)胞系生長(zhǎng)增殖能力的改變，TUNEL染色和流氏細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)FoxP3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞體外克隆形成能力影響;MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)FoxP3基因后對(duì)化療藥物藥物敏感性的差異。體內(nèi)，通過(guò)裸鼠皮下移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證FoxP3基因?qū)ξ赴┥L(zhǎng)的影響。
　　4.Real-time PCR技術(shù)分析胃癌細(xì)胞過(guò)FoxP3基因后TGF-β

6、及相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄情況，ELISA技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxP3基因后一些細(xì)胞因子的分泌情況。Western blot技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)FoxP3基因后凋亡相關(guān)蛋白的改變以及NF-κB相關(guān)信號(hào)通路分子的改變。
　　結(jié)果:
　　1.在胃癌組織中，癌細(xì)胞FoxP3主要表達(dá)于胞漿，弱表達(dá)于胞核，而淋巴細(xì)胞中FoxP3主要表達(dá)于胞核。在多種胃癌細(xì)胞系中，F(xiàn)oxP3表達(dá)于胞漿和胞核。從胃癌前病變、早期胃癌到進(jìn)展期胃癌過(guò)程中，F(xiàn)oxP3 mRNA水

7、平升高(P=0.001)。在胃癌患者中，癌組織高于癌旁組織(P=0.003)。癌組織中FoxP3mRNA水平與TGF-β1(P=0.020,r=0.351),HER2(P=0.002,r=0.443)轉(zhuǎn)錄水平正相關(guān)。從癌前病變、早期胃癌到進(jìn)展期胃癌過(guò)程中，癌細(xì)胞中FoxP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增高，與腫瘤進(jìn)展程度相關(guān)（P=0.008）。腫瘤組織中癌細(xì)胞中FoxP3表達(dá)陽(yáng)性與否以及Treg密度高低與年齡、性別、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不具有相關(guān)性

8、。135例胃癌組織芯片的預(yù)后分析表明，胃癌組織中癌細(xì)胞FoxP3陽(yáng)性的患者，生存時(shí)間長(zhǎng)，預(yù)后好(P=0.042);而癌組織中Treg越多的患者，生存時(shí)間越短，預(yù)后差(P=0.034)。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)FoxP3是預(yù)后的保護(hù)因素，而Treg是預(yù)后的危險(xiǎn)因素。
　　2.胃癌細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)能抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，直接共培養(yǎng)較間接共培養(yǎng)更明顯。共培養(yǎng)后，胃癌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中FoxP3 mRNA和蛋白表達(dá)均增加，而且上清液中TGF-β

9、1，TGF-β2等細(xì)胞因子分泌增加，直接共培養(yǎng)中的細(xì)胞因子水平大于間接共培養(yǎng)。
　　3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FoxP3基因后的胃癌細(xì)胞，與空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，生長(zhǎng)增殖減慢，細(xì)胞凋亡增加，遷移能力減弱，對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染FoxP3的細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤成瘤能力減弱。
　　4.FoxP3基因上調(diào)后使促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)減弱。同時(shí)，NF-κB經(jīng)典通路P65磷酸化減弱和非經(jīng)典通路信號(hào)相關(guān)分子的表

10、達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　1.FoxP3在胃癌組織中表達(dá)增高，陽(yáng)性表達(dá)分布于胃癌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。胃癌組織中腫瘤細(xì)胞FoxP3陽(yáng)性和高密度浸潤(rùn)的Treg對(duì)預(yù)后評(píng)價(jià)有不同的臨床意義。
　　2.FoxP3在癌前疾病及胃癌組織中表達(dá)增高，但是腫瘤細(xì)胞中FoxP3陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后好，可能與FoxP3基因抑制腫瘤生長(zhǎng)促凋亡作用，和腫瘤微環(huán)境多種分子（如TGF-β、HER2），以及與淋巴細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)。同時(shí)，上調(diào)FoxP3對(duì)