雷帕霉素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞功能的影響及機(jī)制探討.pdf

1、雷帕霉素是一種多效性的藥物,具有免疫抑制、抗腫瘤、抗增殖和抗遷移等多種功能,近年被證明除在移植免疫和涂層支架以外還在治療肺淋巴管肌瘤病和結(jié)節(jié)性硬化癥(LAM/TSC)、多囊腎腎病、改善認(rèn)知功能等方面亦有明顯的效果。然而,在脂質(zhì)代謝方面表現(xiàn)的雙面性一直是雷帕霉素的一個(gè)矛盾點(diǎn)。雷帕霉素被證明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化效果,但同時(shí),高脂血癥也一直是雷帕霉素的一個(gè)主要副作用。眾所周知,高脂血癥是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。脂肪組織是體

2、內(nèi)最大的脂質(zhì)儲(chǔ)存器官,被稱為“膽固醇池”,脂肪細(xì)胞內(nèi)膽固醇的平衡能夠影響整個(gè)機(jī)體的膽固醇穩(wěn)態(tài)。另外,脂肪組織還是個(gè)內(nèi)分泌器官,分泌的瘦素、脂聯(lián)素均對(duì)體重、血脂和體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持起重要作用。研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素的使用可以造成體內(nèi)脂肪細(xì)胞重量減少和儲(chǔ)存的脂質(zhì)減少,脂肪細(xì)胞功能紊亂。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵因子,在大多數(shù)脂肪細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄激活前即有表達(dá),在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中通過(guò)正反饋調(diào)控,PPARγ的表達(dá)水平不斷上升,至成熟脂肪細(xì)胞形

3、成時(shí)達(dá)最高。PPARγ的激活可最終導(dǎo)致脂肪分化末期相關(guān)基因的激活。雷帕霉素抑制脂質(zhì)生成和脂肪分化,造成脂肪細(xì)胞功能紊亂是否是通過(guò)抑制PPARγ實(shí)現(xiàn)?本研究觀察雷帕霉素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響,并探討其可能的機(jī)制,旨在為雷帕霉素引起的高脂血癥提供一個(gè)可能的解決辦法。
　　 目的：
　　 研究雷帕霉素對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化后脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和分泌功能的影響及對(duì)PPARγ的影響。
　　 方法：

4、　　 以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用油紅O染色及高效液相色譜分析法(HPLC)定性及定量觀察不同濃度雷帕霉素作用后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的方法分析不同濃度雷帕霉素作用后細(xì)胞分泌脂聯(lián)素和瘦素水平的變化；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度雷帕霉素作用后的3T3-L1細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響；HPLC、ELISA、real-timePCR及Western blot法觀察曲格列酮對(duì)雷帕霉素抑制3T3-L1

5、細(xì)胞分化及分泌效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在分化4天時(shí)開(kāi)始加用不同濃度的雷帕霉素,分化8天時(shí)收獲細(xì)胞做油紅O染色,可以看到在50-200 nmol/L濃度范圍內(nèi)均能減少細(xì)胞內(nèi)脂滴的蓄積。
　　 2.HPLC定量測(cè)定,不同分化時(shí)期加用雷帕霉素對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積的影響差異不明顯,而不同濃度的類帕霉素可以劑量依賴性地減少細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的蓄積,對(duì)照、50、100、200nmol/L濃度雷帕霉素組細(xì)胞內(nèi)FC含量

6、分別為12.89±0.16、9.84±0.45、9.39±0.46、8.61±0.34,各雷帕霉素處理組細(xì)胞內(nèi)FC的濃度均與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.雷帕霉素50、100、200nmol/L均使成熟后3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌的瘦素水平下降(P<0.05),各組脂聯(lián)素的測(cè)定未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 4.作用3T3-L1細(xì)胞96小時(shí)于分化8天收獲細(xì)胞,50nmol/L、100nmo

7、l/L及200nmol/L組PPARγ mRNA表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.93±0.14、0.62±0.10、0.47±0.19倍,后兩組均較對(duì)照組降低(P<0.05),組與組間比較除50nmol/L與100nmol/L之間無(wú)明顯差異之外,其他各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相應(yīng)組內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.80±0.12、0.74±0.11、0.61±0.10倍,后兩組較對(duì)照組降低,組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

8、　　 5.雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210μmol/L、PPARγ增敏劑曲格列酮(Troglitazone,TZD)10μmol/L分別處理細(xì)胞96小時(shí),細(xì)胞分化8天檢測(cè)PPARγ mRNA的表達(dá)分別為對(duì)照組的0.67±0.03、1.3±0.14,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)PPARγ蛋白分別為對(duì)照組的0.57±0.23、1.91±0.12,與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05

9、)。
　　 6.對(duì)照組、PPARγ阻斷劑GW966210μmol/L、PPARγ增敏劑曲格列酮(Troglitazone,TZD)10μ mol/L分別處理細(xì)胞96小時(shí),HPLC測(cè)各組總膽固醇量分別為12.91±0.5、11.88±0.55、13.27±0.71mg/mL,GW9662組細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇比對(duì)照組減少,TZD組總膽固醇比對(duì)照組減少(P<0.05)。ELISA檢測(cè)各相應(yīng)處理組瘦素表達(dá)量變化分別為19.02±0.52、

10、15.62±0.47、17.45±0.51ng/mL,GW9662組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 7.TZD可以逆轉(zhuǎn)雷帕霉素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌功能的抑制,rapa100nmol/L+TZD10μmol/L組的總、游離膽固醇醇值分別為11.28±0.56、10.23±0.33 mg/mL,游離膽固醇值rapa100nmol/L+TZD10μmol/L組與rapa100nmol/L相比升高(P<0.05

11、)。
　　 8.對(duì)照組、rapa100nmol/L、rapa100nmol/L+TZD10μ mol/L處理組細(xì)胞內(nèi)瘦素水平分別為19.02±0.52、15.62±0.47、17.45±0.51ng/mL,rapa100nmol/L+TZD10μ mol/L瘦素水平比rapa100nmol/L高,組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 9.用TZD干預(yù)雷帕霉素效應(yīng),以對(duì)照組值做標(biāo)化,rapa100nmol/L、r

12、apa100nmol/L+TZD10μmol/L組PPARγ mRNA表達(dá)量分別為0.60±0.14、1.12±0.27,與對(duì)照相比,組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),其中,rapa100nmol/L+TZD10μ mol/L組PPARγ表達(dá)量明顯高于rapa100nmol/L組(P<0.05)。PPARγ蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.74±0.11、1.37±0.52,兩組與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05),其中rapa1