阿爾茨海默病中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)胰島素信號(hào)通路功能障礙及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　1、驗(yàn)證在AD細(xì)胞模型及AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中是否存在ERS及胰島素信號(hào)通路功能障礙。
　　2、明確在AD細(xì)胞模型及AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中ERS是否可引起胰島素信號(hào)通路功能障礙。
　　3、探討在AD細(xì)胞模型及AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中ERS引起胰島素信號(hào)通路功能障礙的機(jī)制。
　　方法:
　　1、體外實(shí)驗(yàn):
　　高分化大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）培養(yǎng):
　　購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（目錄

2、號(hào):TCR9），置于37℃、含有5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用添加10％胎牛血清以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)。按照實(shí)驗(yàn)需求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代、凍存、干預(yù)處理及蛋白收集等操作。
　　皮層原代神經(jīng)元培養(yǎng)及鑒定:
　　取新生1天內(nèi)Wistar大鼠乳鼠（購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）皮層組織，按照步驟分離神經(jīng)元，置于37℃、含有5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用添加有2％無(wú)血清B27、0.5％L

3、-谷氨酰胺以及100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的Neurobasal A培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)10天的皮層原代神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。采用MAP2及GFAP免疫熒光染色方法對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　AD轉(zhuǎn)基因小鼠飼養(yǎng)及鑒定:
　　AD轉(zhuǎn)基因小鼠及相應(yīng)野生型(Wild type，WT)小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京模式動(dòng)物研究中心（來(lái)源自Jackson實(shí)驗(yàn)室）。AD轉(zhuǎn)基因小鼠品系名稱(chēng)為B6C3-Tg(APPsw

4、e，PSEN1dE9)85Dbo/Mm JNju，簡(jiǎn)稱(chēng)APP/PS1。飼養(yǎng)室環(huán)境溫度控制在22±3℃，相對(duì)濕度60％，光線(xiàn)自動(dòng)控制，明(07:00-19:00)暗(19:00-07:00)交替。小鼠飼養(yǎng)按照SPF動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)范進(jìn)行。繁殖后代小鼠在1月時(shí)取鼠尾尖DNA進(jìn)行基因型鑒定。9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行Aβ免疫組化染色證實(shí)皮層有大量Aβ沉積，并有明顯水迷宮行為學(xué)改變，符合實(shí)驗(yàn)需要。
　　APP/PS1及WT小鼠行為學(xué)檢測(cè)

5、:
　　采用Morris水迷宮對(duì)不同干預(yù)的WT及APP/PS1小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。全過(guò)程包含1天適應(yīng)期（沒(méi)有平臺(tái)），連續(xù)5天進(jìn)行的定位航行實(shí)驗(yàn)和1天空間探索實(shí)驗(yàn)。
　　3、Aβ1-42寡聚體的制備與鑒定:
　　制備主要按照Rochester醫(yī)學(xué)中心的William J.Bowers教授的方法進(jìn)行。Aβ1-42寡聚體制備后，采用透射電鏡進(jìn)行鑒定，確定寡聚體形成后保存于-80℃。使用時(shí)采用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至合適濃度。

6、>　　采用CCK-8檢測(cè)不同處理?xiàng)l件導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。
　　4、蛋白表達(dá)及磷酸化改變的檢測(cè):
　　采用western blotting檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下PC12細(xì)胞、原代神經(jīng)元、WT及APP/PS1小鼠蛋白表達(dá)及磷酸化改變。包括:①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物:BiP，CHOP;②JNK激活:t-JNK，p-JNK Thr183/Tyr185;③胰島素信號(hào)通路功重要分子:t-IRS-1，p-IRS-1 Ser307，p-IRS-1 Ser31

7、8，p-IRS-1 Ser612，t-Akt，p-Akt Ser473;④AD病理改變:t-Tau，p-Tau Thr181。
　　5、ERS相關(guān)基因mRNA水平的改變:
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因mRNA水平改變，包括:BiP、CHOP、ATF4、GADD34、Nrf2、PUMA、TRB3XBP1s/XBP1u。采用RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)XBP1剪切。
　　6、統(tǒng)

8、計(jì)分析:
　　定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，取p值小于0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。使用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1、Aβ1-42寡聚體增加PC12細(xì)胞IRS-1絲氨酸磷酸化
　　為檢測(cè)胰島素信號(hào)通路功能狀態(tài)，需要使用基礎(chǔ)水平胰島素刺激，首先進(jìn)行胰島素濃度梯度實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的胰島素(0，25，50，100以及200nM)處理30

9、min后，p-IRS-1Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性升高。在25 nM胰島素作用30 min后，p-Akt Ser473磷酸化升高，與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612并未顯著升高。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們選擇了25nM作為PC12細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素濃度。參考既往研究，原

10、代神經(jīng)元的基礎(chǔ)胰島素濃度為1nM。
　　為選擇合適的Aβ1-42寡聚體處理?xiàng)l件，進(jìn)行Aβ1-42寡聚體濃度梯度及時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度Aβ1-42寡聚體(0，0.25，0.5，0.75，1以及2μM，處理時(shí)間為120 min)及不同時(shí)間(0，15，30，60，120以及240 min，處理濃度為1μM)處理后（在收蛋白之前30 min添加濃度為25 nM胰島素刺激），p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Se

11、r318及p-IRS-1 Ser612位點(diǎn)絲氨酸磷酸化呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性以及時(shí)間相關(guān)性升高。Aβ1-42寡聚體處理(1μM，120 min)可顯著升高p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p＜0.05)，降低p-AktSer473磷酸化水平(p＜0.05）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以1μM和120 min作為Aβ1-42寡聚體處理PC12細(xì)胞的條件參數(shù)。參考既往研究，Aβ1-42寡聚

12、體處理原代神經(jīng)元的條件為500 nM及3h。
　　2、Aβ1-42寡聚體、TG處理可誘發(fā)ERS，引起JNK激活并升高IRS-1絲氨酸磷酸化水平
　　在PC12細(xì)胞中，A31-42寡聚體(1μM，120 min)處理可以引起B(yǎng)iP、CHOP蛋白水平升高(p＜0.05)，BiP、CHOP、ATF4、TRB3、PUMA、GADD34、Nrf-2mRNA水平升高(p＜0.05），以及XBP1的剪切。Aβ1-42寡聚體(1μM，120

13、 min)及ERS誘導(dǎo)劑TG(2μM，120 min)可引起p-JNK Thr183/Tyr185磷酸化水平升高(p＜0.05)以及p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1 Ser318和p-IRS-1Ser612磷酸化水平升高(p＜0.05)。Aβ1-42寡聚體(1μM，24 h)及TG（2μM，24h）可引起p-Tau Thr181磷酸化水平升高(p＜0.05)。
　　3、APP/PS1小鼠皮層存在ERS、JNK激活及IR

14、S-1絲氨酸磷酸化水平的升高
　　9月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與同月齡同窩雄性WT小鼠相比，皮層BiP及CHOP表達(dá)升高(p＜0.05)，p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-I Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平升高(p＜0.05)。
　　4、抑制ERS可降低Aβ1-42寡聚體引起的JNK激活、IRS-1絲氨酸磷酸化
　　在皮層原代神經(jīng)元以及PC1

15、2細(xì)胞中，ERS抑制劑PBA預(yù)處理(2mM，3h)可降低Aβ1-42寡聚體處理引起的p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1 Ser307、p-IRS-1Ser318、p-IRS-1 Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p＜0.05)。給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射PBA(200 mg/kg，5周)可改善水迷宮行為學(xué)表現(xiàn)，并降低皮層p-JNKThr183/Tyr185、p-IRS-1Ser307、p-IR

16、S-1Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p＜0.05)。
　　5、抑制JNK激活可降低Aβ1-42寡聚體引起的IRS-1絲氨酸磷酸化
　　在皮層原代神經(jīng)元以及PC12細(xì)胞中，JNK抑制劑SP600125預(yù)處理(25μM，40 min)可降低p-JNKThr183/Tyr185、p-IRS-1Ser307、p-IRS-1Ser318、p-IRS-1 Ser612以及p-Tau Thr181磷酸化(p＜0.

17、05)。給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射SP600125（30 mg/kg，12周）可改善水迷宮行為學(xué)表現(xiàn)，并降低皮層p-JNK Thr183/Tyr185、p-IRS-1Ser307、p-IRS-1 Ser318以及p-IRS-1 Ser612磷酸化水平(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、在Aβ1-42寡聚體處理的PC12細(xì)胞、皮層原代神經(jīng)元，APP/PS1小鼠中存在ERS及胰島素信號(hào)通路功能障礙。
　　2、