水稻新基因OsAAA1的功能初步研究.pdf

1、在植物防御病原菌入侵的反應(yīng)過程中，涉及到植物超敏反應(yīng)、病原菌應(yīng)答基因誘導(dǎo)表達、多種激素信號傳導(dǎo)等反應(yīng)。其中SA介導(dǎo)的信號途徑發(fā)揮重要作用。在前期的研究中，利用基因芯片發(fā)現(xiàn)AAA-ATPase基因家族一個新成員OsAAA1在SA信號途徑中起正調(diào)控作用。AAA基因超家族含有一個保守的ATPase核心結(jié)構(gòu)域和一個α螺旋，AAA超級家族C端結(jié)構(gòu)域在ATP水解、形成寡聚體、結(jié)合輔助因子過程中起重要調(diào)節(jié)作用。其核心結(jié)構(gòu)域包含了保守的Walker A

2、和Walker B序列，一個高度保守的同源次生結(jié)構(gòu)域(SHR)。其中Walker A和Walker B分別是ATP結(jié)合、催化所必須，同時也用于指導(dǎo)ATP中β-和γ-Pi與Mg的結(jié)合。本文對OsAAA1的功能進行了初步研究，主要內(nèi)容包括如下4個方面：
　　1）利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將OsAAA1 RNAi重組載體轉(zhuǎn)入日本晴(NB)愈傷組織中，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、分化、生根培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)過PCR陽性鑒定共得到55株成功插入OsA

3、AA1 RNAi雙鏈的T0代植株，進一步對T1代植株進行RNA表達水平的鑒定，目前得到6株表達量明顯下調(diào)的T1代植株，并收獲T2代種子。表型鑒定正在進行中。
　　2）將融合上GFP的目的基因轉(zhuǎn)化水稻黃化苗原生質(zhì)體中，同時也將目的基因分別和標(biāo)準(zhǔn)蛋白，包括膜定位蛋白、液泡膜定位蛋白、核定位蛋白共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。在激光共聚焦顯微鏡下觀察目的基因的綠色熒光，液泡膜定位蛋白、膜定位蛋白的紅色熒光，根據(jù)各個實驗的定位結(jié)果，初步判定目的蛋白OsA

4、AA1定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。
　　3）構(gòu)建pET-32a-OsAAA1蛋白表達載體，摸索蛋白最優(yōu)表達條件，純化可溶性目的蛋白，然后進行ATPase酶活測定。經(jīng)Ni柱純化蛋白，Western blotting進一步檢測表明目的蛋白得到表達純化，并且單一性較好。將純化蛋白進行ATPase酶活檢測，得到的酶活含量很低，不能用于計算。目前正在著力解決這一問題。
　　4）成功構(gòu)建稻瘟病菌誘導(dǎo)型啟動子重組載體PPR1b-ADH-OsA