水稻雌性不育基因PTB1載體構(gòu)建及初步功能分析.pdf

1、人類的糧食主要來(lái)自于植物的果實(shí)，植物的育性水平直接關(guān)系到產(chǎn)量的高低。植物雌性不育雖然對(duì)植物本身不利，但是對(duì)于植物育性機(jī)理研究卻是一個(gè)良好的切入點(diǎn)。自上個(gè)世紀(jì)50年代就開(kāi)始有植物雌性不育現(xiàn)象的報(bào)道以來(lái)，植物的雌性不育現(xiàn)象就長(zhǎng)期受到廣泛的的關(guān)注，但是對(duì)其不育的機(jī)理還知之甚少。近年來(lái)，科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定出了很多生殖相關(guān)突變體或基因，部分生殖發(fā)育的相關(guān)機(jī)制也在逐漸明朗。但是，還有很多有關(guān)生殖發(fā)育分子機(jī)理還知之甚少，而這些機(jī)理的深入探討有待于

2、更多突變體的發(fā)掘和研究。本實(shí)驗(yàn)研究的突變體材料來(lái)自一份穩(wěn)定的秈稻恢復(fù)系蜀恢202的自然突變材料，它不同于所報(bào)道過(guò)的秈粳交后代及離體培養(yǎng)產(chǎn)生的雌性不育突變體，而且其外部的表型特征就與目前報(bào)道過(guò)的突變體有較大差異，有可能是一個(gè)全新類型的雌性不育突變材料。因此，對(duì)它的深入研究將是對(duì)雌性不育研究的一個(gè)重大補(bǔ)充。
　　 本研究以一份源自秈型恢復(fù)系蜀恢202的自然不育突變株作為材料。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，已將該基因精細(xì)定位在水稻第五染色體

3、上60k范圍內(nèi)，并經(jīng)序列比對(duì)分析篩選出候選基因，并構(gòu)建好部分用于基因功能驗(yàn)證的中間載體PBS-PT,PBS-Ppt,PBS-PI1,PBS-PI2。本研究以這些中間載體為基礎(chǔ)構(gòu)建PTBI基因過(guò)量表達(dá)，互補(bǔ)，RNA干擾，組織表達(dá)等真核表達(dá)載體，和蛋白細(xì)胞定位瞬時(shí)表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化水稻、擬南芥和洋蔥等，以研究該基因的功能和表達(dá)模式特征。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以構(gòu)建好的中間載體PBS-PT,PBS

4、-Ppt,PBS-PI1,PBS-PI2為供體，以植物表達(dá)載體PHB為受體構(gòu)建PTB1基因過(guò)量表達(dá)載體PHB-PT-OVE、互補(bǔ)表達(dá)載體PHB-Ppt-PT、RNA干擾表達(dá)載體PHB-PI1和PHB-PI2;以真核表達(dá)載體P1300-GUS為受體構(gòu)建PTB1基因組織表達(dá)載體P1300-Ppt-GUS;以瞬時(shí)表達(dá)載體PA7-YFP為受體構(gòu)建PTB1蛋白細(xì)胞定位瞬時(shí)表達(dá)載體PA7-35s-PT-YFP。并通過(guò)酶切和測(cè)序的方法鑒定上述表達(dá)載體

5、的正確性。
　　 2.將PTB1基因互補(bǔ)表達(dá)載體PHB-Ppt-PT利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入fs-202R突變體幼穗誘導(dǎo)的胚性愈傷組織中，經(jīng)組織培養(yǎng)，抗性篩選分化，獲得再生抗性植株。經(jīng)PCR和Basta除草劑檢測(cè)，成功獲得了14株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
　　 3.將獲得的T0代陽(yáng)性植株種子分單株種植5個(gè)株系，在成熟期進(jìn)行田間調(diào)查，觀察到每個(gè)株系內(nèi)T1代均發(fā)生可育和不可育的性狀分離。T1代植株經(jīng)PCR和Basta檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的基因

6、與與植株育性恢復(fù)性狀緊密連鎖，表明通過(guò)目的基因的導(dǎo)入恢復(fù)了突變體的育性。
　　 4.將PTB1基因組織表達(dá)載體P1300-Ppt-GUS通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入擬南芥并獲得抗性植株。將整株陽(yáng)性小苗和成熟苗的組織器官進(jìn)行GUS染色，結(jié)果表明GUS基因在擬南芥幼苗和營(yíng)養(yǎng)器官中的維管束組織表達(dá)，在生殖器官中則在雌蕊和雄蕊中表達(dá)。
　　 5.利用基因槍法將PTB1基因蛋白細(xì)胞定位瞬時(shí)表達(dá)載體PA7-35s-PT-YFP導(dǎo)入洋蔥表

7、皮細(xì)胞，得到洋蔥瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)洋蔥瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)YFP基因在洋蔥的細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中均有表達(dá)。
　　 6.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將PTBI基因過(guò)量表達(dá)載體PHB-PT-OVE導(dǎo)入fs-202R突變體幼穗誘導(dǎo)和Kasa1ath成熟胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織中，經(jīng)組織培養(yǎng)，抗性篩選分化，獲得再生抗性小苗?？剐灾仓杲?jīng)PCR檢測(cè)，成功獲得3株fs-202R轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性幼苗和10株Kasalath轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗