非生物脅迫下暖季型草坪草內(nèi)參基因篩選及鐵離子調(diào)控耐鹽性的機(jī)制研究.pdf

1、內(nèi)參基因是維持生物體生命活動(dòng)的細(xì)胞器骨架的重要組成部分和參與生命代謝活動(dòng)的基本單元，不受時(shí)空影響而在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。選取適宜的內(nèi)參基因?qū)趯?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行精確的基因表達(dá)分析具有重要意義。本研究第一部分以典型暖季型草坪草狗牙根（Cynodon dactylon）為材料，在鹽、干旱、高溫和低溫四種非生物脅迫下，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析了ACT、 EF1α、 TUB、PP2A、TIP41、CACS、UPL7和GAPDH8個(gè)

2、候選內(nèi)參基因在不同組織和不同非生物脅迫下的表達(dá)情況，并利用Genorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder四種程序，計(jì)算分析基因表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明:在鹽、干旱、冷和高溫四種非生物脅迫下，8個(gè)內(nèi)參基因在狗牙根葉片和根系中的表達(dá)穩(wěn)定性存在差異，其中，PP2A和CACS在鹽脅迫下根和葉片中、干旱脅迫下葉片中、冷或熱脅迫下根中表達(dá)穩(wěn)定性較高，EF1α和TIP41在干旱脅迫下根系中能較穩(wěn)定表達(dá)，UPL7、TUB和GA

3、PDH在冷脅迫下葉片中穩(wěn)定表達(dá)，PP2A和TIP41在熱脅迫下葉片中穩(wěn)定表達(dá)。
　　海濱雀稗(Paspalum vaginatum)是多年生暖季型鹽生草坪植物，實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)酵母篩選從海濱雀稗耐鹽品種‘Sea Isle2000’全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(kù)中捕獲得一個(gè)耐鹽候選基因——鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，由此推測(cè)海濱雀稗優(yōu)異的耐鹽性歸因于在高鹽環(huán)境中具有超強(qiáng)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力，維持植物體內(nèi)的離子平衡。而鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素之一，參與葉綠素合成、

4、光合呼吸代謝途徑，海濱雀稗的耐鹽性可能與鐵吸收相關(guān)?；诖耍_展了以下試驗(yàn):
　　1、以海濱雀稗(Paspalum vaginatum)耐鹽品種‘Sea Isle2000’為材料，通過(guò)基因克隆得到耐鹽候選基因——鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體PvIRT(cDNA全長(zhǎng)1107bp、編碼369aa)，異源轉(zhuǎn)化鹽敏感的酵母細(xì)胞，顯著提高了其耐鹽性。通過(guò)qRT-PCR及錨定PCR等方法，進(jìn)一步明確了PvIRT基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式（鹽處理抑制根系PvIR

5、T表達(dá)）及克隆了PvIRT基因的上游1134bp的啟動(dòng)子序列，結(jié)果顯示PvIRT基因受鹽脅迫顯著下調(diào)表達(dá),PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析PvIRT啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子包含了許多脅迫相關(guān)的順式元件，如MYB-site，bHLH-site，ABA誘導(dǎo)，鹽脅迫誘導(dǎo)，JA或病原體誘導(dǎo)元件;此外，瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明PvIRT蛋白定位于擬南芥原生質(zhì)體的細(xì)胞膜上。這為進(jìn)一步研究該基因分子調(diào)控機(jī)制提供了線索。
　　2、以海濱雀稗(Paspalum vagin

6、atum)耐鹽品種‘Sea Isle2000’為試驗(yàn)材料，采用水培法研究了鹽脅迫和正常生長(zhǎng)條件下，比較了正常鐵濃度(20μ mol/L)和高濃度鐵(80μ mol/L)處理后對(duì)海濱雀稗生物量、葉片含水量、光合特性、根系活力和地上部和根系中Na+、K+和Fe2+等離子含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)條件下，高濃度鐵處理對(duì)海濱雀稗地上部和根系生物量，葉片的葉綠素含量、光合速率、光化學(xué)效率、相對(duì)含水量、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度無(wú)顯著差異，而明顯提高根

7、系離子含量(K+，Mg2+,Mn2+，F(xiàn)e2+，Cu2+)和葉片離子含量(Mn2+，Cu2+)。鹽脅迫下，高濃度鐵(80μmol/L)處理表現(xiàn)出較高的根系活力和地上部生物量，同時(shí)顯著提高海濱雀稗的Fe2+、Mg2+和Cu2+等元素的含量，提高葉片的葉綠素含量、光化學(xué)效率和光合能力，促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育;且植株根系通過(guò)增加對(duì)K+的吸收和Na+外排，維持細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)，減少鈉離子毒害，提高了海濱雀稗的耐鹽性。
　　3、以海濱雀稗(Paspa

8、lum vaginatum)耐鹽品種‘Sea Isle2000’的根系為試驗(yàn)材料，采用水培法研究了正常生長(zhǎng)下和鹽脅迫（10天）下，高濃度鐵(80μmol/L)處理對(duì)海濱雀稗根系Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體(PvSOS1，PvCIPK24，PvCBL4)、Na+/K轉(zhuǎn)運(yùn)體(PvCBL4)以及H+-質(zhì)子泵(PvP-H+-ATPase, PvV-H+-ATPase)等基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)條件下，高濃度鐵處理顯著降低了PvCBL4和PvCB

9、L4基因表達(dá)，而位于液泡膜的V-H+-ATPase基因表達(dá)量大幅度增加;鹽脅迫下，高濃度鐵(80μmol/L)誘導(dǎo)了 PvSOS1，PvCIPK24，PvCBL4和PvCBL4、PvV-H+-ATPase等基因表達(dá)。因此，鹽脅迫下，高濃度鐵通過(guò)提高液泡膜上的PvV-H+-ATPase基因表達(dá)，為液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，將過(guò)量的鈉離子液泡區(qū)域化，同時(shí)上調(diào)質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，將Na+排到胞外，減少了鈉離