棉花鹽脅迫誘導cDNA文庫的構建及耐鹽基因的篩選與鑒定.pdf

1、棉花是較耐鹽堿的作物之一，對改良和有效利用鹽漬地具有重要意義。但棉花的耐鹽能力有限，要在鹽堿地廣泛種植，必須進一步提高棉花的耐鹽能力。傳統(tǒng)的常規(guī)育種方法無法大幅度提高棉花的耐鹽性，分子生物學的發(fā)展，為大幅度提高棉花的耐鹽性提供了新的方法。但要通過轉(zhuǎn)基因技術提高棉花的耐鹽性，首先要了解棉花耐鹽的分子機制，并解決基因來源問題。而這兩個問題解決的基礎首先是要克隆到足夠多的與棉花耐鹽相關的基因。而目前大規(guī)?？寺∨c耐鹽相關基因的最有效方法之一就是

2、cDNA文庫篩選法。本研究以耐鹽棉花品種中棉19號為材料，構建了棉花鹽脅迫誘導cDNA文庫，對文庫的篩選鑒定表明，構建的棉花子葉cDNA文庫質(zhì)量較好。通過反相Northern差異篩選法獲得17個與鹽脅迫相關的新基因。并選擇5號、17號、21號和30號克隆進行功能研究分析。研究發(fā)現(xiàn)5號和17號克隆屬于棉花金屬硫蛋白基因家族成員，30號克隆是PPIC型(PPIC-PPIASE-2)-肽酰脯氨酰順反異構酶(parvulin-type pept

3、idyl-prolyl cis/trans isomerase)，而2l號克隆可能是一種紫外線B抑制蛋白。 金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類低分子量(6000～9000Da)、高Cys含量、具有金屬結合能力的多肽，它具有獨特的氨基酸排列順序，即多肽的N端和C端具有兩個富含Cys的金屬結合結構域，其中的Cys按CXnC的方式排列。MT基因和蛋白廣泛存在于動物、植物、真菌、綠藻中。植物金屬硫蛋白按結構特點分為

4、三類。5號克隆編碼的GhMT1與17號克隆編碼的GhMT2為棉花I類金屬硫蛋白。對這兩個基因進行序列比較、表達分析和功能鑒定。主要結果如下： 1.5號克隆和17號克隆的序列同源性分析表明，二者的核苷酸序列的同源性為91.15％，氨基酸同源性為85.94％，可以斷定二者為同一棉花基因家族成員。該基因家族編碼蛋白與覆盆子、葡萄、中華獼猴桃、番木瓜等許多植物中的I類金屬硫蛋白的同源性為70.1％，具有典型的植物I類金屬硫蛋白序列特點，

5、聚類分析表明該棉花基因家族與覆盆子、葡萄、中華獼猴桃、番木瓜等植物的I類金屬硫蛋白具有較近的親緣關系。因此，可以斷定二者屬于植物I類金屬硫蛋白，命名為GhMT1、GhMT2。 2.Northern雜交分析表明GhMT1受NaCl脅迫誘導表達，在一定的時間范圍內(nèi)其表達水平隨NaCl誘導時間的延長而增加，但是在鹽脅迫條件下不能被快速誘導。GhMT1也能被CuSO4、ZnSO4、低溫、干旱、ABA和乙烯誘導，說明GhMT1具有金屬硫蛋

6、白受重金屬誘導的功能，也說明對鹽脅迫的非專一性，而是受各種非生物脅迫的誘導。同時暗示著GhMT1受ABA和乙烯信號途徑的調(diào)控，可能是ABA、乙烯信號途徑的靶基因。 3.Northern表達分析還表明在抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)存在的條件下，GhMT1不受NaCl、低溫、干旱、百草枯(PQ，paraquat)的誘導。對過氧化氫相對水平的測定結果表明，NAC有效的抑制了NaCl

7、、低溫、干旱脅迫條件下過氧化氫水平。說明活性氧自由基是非生物脅迫誘導GhMT1及其同源家族表達的重要信號物質(zhì)。 4.GhMT1和GhMT2在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達，用GhMT1和GhMT2特異探針進行檢測，Northern雜交結果說明GhMT1和GhMT2只在轉(zhuǎn)基因植株中表達。同野生型相比，超表達GhMT1和GhMT2的轉(zhuǎn)基因煙草在200mM NaCl、300mM NaCl條件下以及4℃條件下與25％PEG條件下較好的生長。說明G

8、hMT1及其同源家族能提高植物的抗鹽能力，也能提高植物的抗其它主要非生物脅迫的能力。 5.對轉(zhuǎn)基因煙草生理指標測定結果表明，在鹽、4℃、25％PEG脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草SOD酶活性明顯高于野生型煙草。說明GhMT1能夠提高植物清除活性氧自由基能力，從而提高植物抗鹽、抗低溫及抗干旱等非生物脅迫的能力。 6.對GhMT1體外結合Zn2+能力的測定表明，GhMT1具有金屬硫蛋白家族能夠結合金屬離子的特性，每一分子GhMT1最多

9、能結合5個鋅離子。 肽酰脯氨酰順反異構酶(peptidyl proline cis/trans isomerase，PPlase)是一種催化肽酰-脯氨酰的肽鍵順反異構的一類酶，在進化上高度保守，成員多樣，并且分布廣泛，在生物體的生理過程中發(fā)揮重要的作用。脯氨酰異構酶超家族可以分為FK506結合蛋白(FK506-binding proteins，F(xiàn)KBPs)、親環(huán)素(cyclophilins，Cyp)和Parvulins三個獨立的

10、蛋白家族，每個家族又有眾多成員。30號克隆編碼的GhPPI是Parvulins家族中的肽酰脯氨酰順反異構酶，對這個基因進行序列比較、表達分析和功能鑒定。主要結果如下： 1.序列同源比較分析表明，棉花GhPPI具有PPIC-PPIASE-2(PPIC型-肽酰脯氨酰順反異構酶)保守區(qū)，是parvulin家族順反異構酶中的成員，酶學分類為(EC5.2.1.8)。同源蛋白聚類分析表明GhPPI和擬南芥AtPIN2以及水稻中的肽酰脯氨酰順

11、反異構酶具有高達92％以上的同源性，與人的Par14和Par17也有高達55％的同源性。棉花GhPPI除具有順反異構酶保守區(qū)外，N端還具有富含Lys的堿性氨基酸區(qū)。通過綜合比較分析表明，棉花GhPPI可能是parvulin家族人Par17類型成員。 2.跨膜區(qū)分析表明，棉花GhPPI沒有跨膜區(qū)。GhPPI-GFP融合蛋白洋蔥表皮亞細胞定位表明，GhPPI主要定位于細胞核中，并與染色體結合。核定位信號分析表明，沒有明顯的核定位信號

12、。前人研究表明Par14和Par17的核定位信號位于N端富含Lys的堿性氨基酸區(qū)，并不剪切去，并且N端的堿性氨基酸區(qū)是結合DNA所必需的。推測GhPPI與Par14和Par17具有高度同源的N端富含堿性氨基酸區(qū)也具有相似功能。 3.通過原核表達純化到了棉花GhPPI蛋白，選用N-Succingl-Ala-Ala-Pro-Phe-4-nitroanilides底物，對棉花GhPPI蛋白順反異構酶活性進行分析測定。結果表明棉花GhP

13、PI蛋白具有較低的順反異構酶活性。棉花GhPPI蛋白是植物中第一個鑒定的具有順反異構酶活性的parvulin家族中的成員。 4.用Nonhero雜交技術進一步分析棉花GhPPI的內(nèi)源表達情況。結果顯示，GhPPI有一定的本底表達水平，受300mM NaCl誘導后，其表達水平升高，并在一定的時間范圍內(nèi)隨NaCl誘導時間的延長而增加。說明GhPPI順反異構酶活性與植物抗脅迫有一定的關系。 5.前人將AtPIN2分類到parv

14、ulin家族人hPar14類型中，通過對我們實驗結果分析討論發(fā)現(xiàn)，AtPIN2與GhPPI同源性高達93％，將兩者歸類到的parvulin家族人JaPar17類型更科學。GhPPI的許多研究結果都暗示GhPPI與hPar17功能類似，推測GhPPI可能也具有hPar17的相似功能。 6.從擬南芥中克隆到棉花GhPPI在擬南芥中的同源基因AtPIN2基因，構建了AtPIN2基因的超表達、反義表達載體和RNAi干涉載體，并獲得相應的

15、轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)現(xiàn)AtPIN2基因RNAi干涉的T0代擬南芥幼苗生長迅速。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得，為通過采用反向遺傳學方法研究AtPIN2和GhPPI等parvulin家族基因功能創(chuàng)造了條件。 高等植物的光受體可分為4種類型：光敏色素(phytochrome)、隱花色素(cryptochrome)、趨光素(phototropin)和超級色素(superchrome)。其中，隱花色素和趨光素都能吸收藍光，屬于藍光受體。21號克隆Gh

16、UVB1可能編碼一種紫外線B抑制蛋白。對GhUVB1進行初步的結構與功能鑒定分析，結果如下： 1.氨基酸序列多重對比分析表明棉花GhUVB1編碼蛋白在第60個氨基酸到第114個氨基酸的區(qū)域內(nèi)具有“aaaxxxxmxxpxxaxaaxxxxxpslknfllsixxggxvxxxixgxvxxvsnfdpvk”高度保守區(qū)域，與之同源性較高的蛋白多數(shù)屬于紫外線B抑制蛋白。進一步同源分析比較表明，棉花GhUVB1與光系統(tǒng)II的X亞基(

17、PsbX類似蛋白)也有一定的同源性，也可能是PsbX類似蛋白。 2.跨膜區(qū)分析表明，棉花GhUVB1沒有跨膜區(qū)。GhUVB1-GFP綠色熒光融合蛋白洋蔥內(nèi)表皮亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，GhUVB1主要定位于細胞膜上，而細胞核等部位也發(fā)現(xiàn)有綠色熒光的存在，但分布不均勻，推測GhUVB1也定位于細胞核膜上。這與GhUVB1蛋白的跨膜區(qū)理論分析相吻合。 3.構建了棉花GhUVB1蛋白的超表達載體，并轉(zhuǎn)化到擬南芥中超表達，結果發(fā)現(xiàn)超表