新型自組裝多肽支架對(duì)小鼠MSCs的粘附、增殖及成骨效應(yīng)的體外研究.pdf

1、背景：骨移植是一種臨床上常用的修復(fù)骨缺損的方法。自體骨移植雖然是修復(fù)骨大段缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，但受到供體骨來(lái)源不足、造成新的骨缺損和疼痛等缺點(diǎn)的限制。骨組織工程的迅速發(fā)展，為骨缺損的修復(fù)帶來(lái)了新的選擇。
　　目前，骨組織工程三要素之一的支架材料成為研究的熱點(diǎn)。多種支架材料的出現(xiàn)為修復(fù)骨缺損提供了更多的選擇，但在研究中也發(fā)現(xiàn)這些支架材料尚有很多不足:同種異體骨具有天然骨組織結(jié)構(gòu)，但可能引發(fā)免疫反應(yīng)、傳播疾病;人工合成修復(fù)材料可大量生產(chǎn)，但

2、存在材料表面親水性差，細(xì)胞不易粘附，缺乏成骨誘導(dǎo)性能等缺點(diǎn)。
　　自組裝多肽由人工合成，成分是氨基酸，在水中溶解時(shí)自發(fā)組裝成納米纖維并相互搭載形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。纖維直徑10～20nm，孔徑5～200nm，含水量超過(guò)99％。向自組裝肽溶液中加入鹽離子可以使其迅速形成水凝膠。這種水凝膠支架的優(yōu)勢(shì)有:1、水凝膠有著與細(xì)胞外基質(zhì)類似的微環(huán)境，利于細(xì)胞的粘附、增殖及分化;2、成分明確，降解產(chǎn)物是短肽或者氨基酸，生物相容性較好;3、有一定的可塑性

3、。RADA16-Ⅰ是經(jīng)典的自組裝多肽，序列是AcN-RADARADARADARADA-CONH2，已有多篇細(xì)胞附著生長(zhǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道。最近，多名學(xué)者用不同的功能基序修飾RADA16-Ⅰ，研究發(fā)現(xiàn)這些新型功能化自組裝多肽構(gòu)建的水凝膠支架對(duì)細(xì)胞的粘附、增殖和分化有良好的促進(jìn)作用。
　?、裥湍z原來(lái)源的DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)序列能夠作用于α2β1整合素受體，對(duì)細(xì)胞粘附有促進(jìn)作用?；谝陨匣A(chǔ)，將DGEA基序用固相合成法同R

4、ADA16-Ⅰ的C端結(jié)合，得到新的功能化自組裝多肽RAD-DGEA，序列是AcN-RADARADARADARADA-GG-DGEA-CONH2，但在觀察其微觀結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)它只能形成短的纖維并且相互之間不搭載。將RADA/DGEA與RADA16-Ⅰ等比混合配制成DGEAmx，發(fā)現(xiàn)DGEAmx可以形成與RADA16-Ⅰ類似的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。將C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在空白玻片、RADA16-Ⅰ水凝膠和DGEAmx水凝膠這3組材料上

5、進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)細(xì)胞的粘附、增殖和分化情況，以期得到一種理想的骨修復(fù)支架材料。
　　目的:(1)觀察自組裝多肽的微觀結(jié)構(gòu);
　　(2)檢測(cè)細(xì)胞在材料上的粘附率;
　　(3)檢測(cè)細(xì)胞在材料上的增殖情況;
　　(4)檢測(cè)成骨細(xì)胞分化指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)活性、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-Ⅰ)、骨鈣蛋白(OCN)的表達(dá)以評(píng)價(jià)成骨效果。
　　方法:(1)原子力顯微鏡觀察(AFM)自組裝多肽的微觀結(jié)構(gòu):將自組裝多

6、肽配制成肽溶液，稀釋后將多肽溶液滴加在新剝離開的云母片表面，待干燥后在原子力顯微鏡下觀察多肽的微觀結(jié)構(gòu)。
　　(2)鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞在材料上的粘附率:在24孔板內(nèi)放置無(wú)菌蓋玻片并將自組裝多肽溶液滴加在玻片上，加入培養(yǎng)基使其成膠。將小鼠MSCs懸液加入培養(yǎng)孔。在加入細(xì)胞懸液后的10、30、60、90min時(shí)分別對(duì)各組材料上粘附的細(xì)胞拍照并隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　(3) CCK-8法對(duì)比細(xì)胞在材料上的增殖情況:細(xì)胞

7、培養(yǎng)在各組材料表面，在培養(yǎng)的第1、3、5、7天用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖。
　　(4)細(xì)胞骨架檢測(cè):在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3、7、14天時(shí)用鬼筆環(huán)肽和DAPI為細(xì)胞骨架和細(xì)胞核染色，激光共聚焦鏡下觀察并拍照。
　　(5)檢測(cè)成骨細(xì)胞分化指標(biāo)堿性磷酸酶活性、細(xì)胞間粘附分子-1、骨鈣蛋白的表達(dá)以評(píng)價(jià)成骨效果:將細(xì)胞在各組材料上成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3、7、14天時(shí)用堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性，real-time

8、PCR檢測(cè)細(xì)胞間粘附分子-1和骨鈣蛋白。
　　結(jié)果:(1) DGEA肽不能形成纖維結(jié)構(gòu);RADA16-Ⅰ可以形成均勻的長(zhǎng)纖維結(jié)構(gòu)并相互搭載成網(wǎng)狀;RAD-DGEA只能形成短的纖維結(jié)構(gòu)，但當(dāng)RAD-DGEA與RADA16-Ⅰ等比混合配制成的DGEAmx可以形成類似于RADA16-Ⅰ的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)AFM結(jié)果，將后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料分為3組:空白玻片組，RADA16-Ⅰ組，DGEAmx組。
　　(2)3組材料在不同時(shí)間點(diǎn)粘附細(xì)胞數(shù)經(jīng)

9、過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在第10min時(shí)，各組間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）;而在第30、60、90min時(shí)各組粘附細(xì)胞數(shù)之間分別有顯著性差異(P＜0.05)。
　　(3)細(xì)胞在3組不同材料上的增殖情況，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在培養(yǎng)1天時(shí)，各組之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）;在培養(yǎng)3天時(shí)， DGEAmx組高于空白組(P＜0.05);在培養(yǎng)5天時(shí)，各組間分別有顯著性差異（P＜0.05）;在培養(yǎng)7天時(shí)，DGEAmx組高于其他兩組（P＜0.05）。

10、
　　(4)共聚焦顯微鏡下觀察，在不同時(shí)間點(diǎn)相同倍數(shù)下DGEAmx組有更高的細(xì)胞數(shù)量，并且細(xì)胞鋪展完全，可以觀察到粗大的細(xì)胞骨架。
　　(5)在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的3、7、14天時(shí)，比較3組材料上的細(xì)胞ALP活性，3組之間分別有顯著性差異（P＜0.05）;比較3組材料上ICAM-Ⅰ和OCN的表達(dá)，DGEAmx組均高于其他兩組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:支架材料作為骨組織工程的三要素之一，在性能方面有著諸多要求。自組裝多肽作

11、為一種人工合成的材料，擁有能夠批量生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。其形成的水凝膠有著類似于天然的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的結(jié)構(gòu)，具有較高的含水量和孔隙度，是適合細(xì)胞附著和生長(zhǎng)的載體。其合成材料是氨基酸，降解產(chǎn)物無(wú)毒性，能避免炎癥和免疫反應(yīng)。本研究用固相合成法將功能基序DGEA加入RADA16-Ⅰ并構(gòu)建了DGEAmx水凝膠，觀察了自組裝多肽的微觀結(jié)構(gòu)并對(duì)細(xì)胞在多肽水凝膠表面的粘附、增殖和分化進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明DGEAm