新型自組裝多肽支架對小鼠MSCs的粘附、增殖及成骨效應的體外研究.pdf

1、背景：骨移植是一種臨床上常用的修復骨缺損的方法。自體骨移植雖然是修復骨大段缺損的金標準，但受到供體骨來源不足、造成新的骨缺損和疼痛等缺點的限制。骨組織工程的迅速發(fā)展，為骨缺損的修復帶來了新的選擇。
　　目前，骨組織工程三要素之一的支架材料成為研究的熱點。多種支架材料的出現(xiàn)為修復骨缺損提供了更多的選擇，但在研究中也發(fā)現(xiàn)這些支架材料尚有很多不足:同種異體骨具有天然骨組織結構，但可能引發(fā)免疫反應、傳播疾病;人工合成修復材料可大量生產，但

2、存在材料表面親水性差，細胞不易粘附，缺乏成骨誘導性能等缺點。
　　自組裝多肽由人工合成，成分是氨基酸，在水中溶解時自發(fā)組裝成納米纖維并相互搭載形成網狀結構。纖維直徑10～20nm，孔徑5～200nm，含水量超過99％。向自組裝肽溶液中加入鹽離子可以使其迅速形成水凝膠。這種水凝膠支架的優(yōu)勢有:1、水凝膠有著與細胞外基質類似的微環(huán)境，利于細胞的粘附、增殖及分化;2、成分明確，降解產物是短肽或者氨基酸，生物相容性較好;3、有一定的可塑性

3、。RADA16-Ⅰ是經典的自組裝多肽，序列是AcN-RADARADARADARADA-CONH2，已有多篇細胞附著生長的文獻報道。最近，多名學者用不同的功能基序修飾RADA16-Ⅰ，研究發(fā)現(xiàn)這些新型功能化自組裝多肽構建的水凝膠支架對細胞的粘附、增殖和分化有良好的促進作用。
　?、裥湍z原來源的DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)序列能夠作用于α2β1整合素受體，對細胞粘附有促進作用。基于以上基礎，將DGEA基序用固相合成法同R

4、ADA16-Ⅰ的C端結合，得到新的功能化自組裝多肽RAD-DGEA，序列是AcN-RADARADARADARADA-GG-DGEA-CONH2，但在觀察其微觀結構時發(fā)現(xiàn)它只能形成短的纖維并且相互之間不搭載。將RADA/DGEA與RADA16-Ⅰ等比混合配制成DGEAmx，發(fā)現(xiàn)DGEAmx可以形成與RADA16-Ⅰ類似的纖維網狀結構。將C57小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)在空白玻片、RADA16-Ⅰ水凝膠和DGEAmx水凝膠這3組材料上

5、進行培養(yǎng)，并檢測細胞的粘附、增殖和分化情況，以期得到一種理想的骨修復支架材料。
　　目的:(1)觀察自組裝多肽的微觀結構;
　　(2)檢測細胞在材料上的粘附率;
　　(3)檢測細胞在材料上的增殖情況;
　　(4)檢測成骨細胞分化指標堿性磷酸酶(ALP)活性、細胞間粘附分子-1(ICAM-Ⅰ)、骨鈣蛋白(OCN)的表達以評價成骨效果。
　　方法:(1)原子力顯微鏡觀察(AFM)自組裝多肽的微觀結構:將自組裝多

6、肽配制成肽溶液，稀釋后將多肽溶液滴加在新剝離開的云母片表面，待干燥后在原子力顯微鏡下觀察多肽的微觀結構。
　　(2)鏡下細胞計數(shù)法檢測細胞在材料上的粘附率:在24孔板內放置無菌蓋玻片并將自組裝多肽溶液滴加在玻片上，加入培養(yǎng)基使其成膠。將小鼠MSCs懸液加入培養(yǎng)孔。在加入細胞懸液后的10、30、60、90min時分別對各組材料上粘附的細胞拍照并隨機選取3個視野進行計數(shù)。
　　(3) CCK-8法對比細胞在材料上的增殖情況:細胞

7、培養(yǎng)在各組材料表面，在培養(yǎng)的第1、3、5、7天用CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖。
　　(4)細胞骨架檢測:在成骨誘導培養(yǎng)的第3、7、14天時用鬼筆環(huán)肽和DAPI為細胞骨架和細胞核染色，激光共聚焦鏡下觀察并拍照。
　　(5)檢測成骨細胞分化指標堿性磷酸酶活性、細胞間粘附分子-1、骨鈣蛋白的表達以評價成骨效果:將細胞在各組材料上成骨誘導培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3、7、14天時用堿性磷酸酶活性檢測試劑盒檢測ALP活性，real-time

8、PCR檢測細胞間粘附分子-1和骨鈣蛋白。
　　結果:(1) DGEA肽不能形成纖維結構;RADA16-Ⅰ可以形成均勻的長纖維結構并相互搭載成網狀;RAD-DGEA只能形成短的纖維結構，但當RAD-DGEA與RADA16-Ⅰ等比混合配制成的DGEAmx可以形成類似于RADA16-Ⅰ的纖維網狀結構。根據(jù)AFM結果，將后續(xù)實驗材料分為3組:空白玻片組，RADA16-Ⅰ組，DGEAmx組。
　　(2)3組材料在不同時間點粘附細胞數(shù)經

9、過統(tǒng)計學處理，在第10min時，各組間沒有顯著性差異（P＞0.05）;而在第30、60、90min時各組粘附細胞數(shù)之間分別有顯著性差異(P＜0.05)。
　　(3)細胞在3組不同材料上的增殖情況，經統(tǒng)計學處理，在培養(yǎng)1天時，各組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）;在培養(yǎng)3天時， DGEAmx組高于空白組(P＜0.05);在培養(yǎng)5天時，各組間分別有顯著性差異（P＜0.05）;在培養(yǎng)7天時，DGEAmx組高于其他兩組（P＜0.05）。

10、
　　(4)共聚焦顯微鏡下觀察，在不同時間點相同倍數(shù)下DGEAmx組有更高的細胞數(shù)量，并且細胞鋪展完全，可以觀察到粗大的細胞骨架。
　　(5)在成骨誘導培養(yǎng)的3、7、14天時，比較3組材料上的細胞ALP活性，3組之間分別有顯著性差異（P＜0.05）;比較3組材料上ICAM-Ⅰ和OCN的表達，DGEAmx組均高于其他兩組（P＜0.05）。
　　結論:支架材料作為骨組織工程的三要素之一，在性能方面有著諸多要求。自組裝多肽作

11、為一種人工合成的材料，擁有能夠批量生產的優(yōu)勢。其形成的水凝膠有著類似于天然的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的結構，具有較高的含水量和孔隙度，是適合細胞附著和生長的載體。其合成材料是氨基酸，降解產物無毒性，能避免炎癥和免疫反應。本研究用固相合成法將功能基序DGEA加入RADA16-Ⅰ并構建了DGEAmx水凝膠，觀察了自組裝多肽的微觀結構并對細胞在多肽水凝膠表面的粘附、增殖和分化進行了檢測，結果表明DGEAm