載TCG-β3基因的自組裝肽支架與前軟骨干細(xì)胞體外成軟骨效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：
　　 為研究關(guān)節(jié)軟骨與骺板損傷的基因治療創(chuàng)造條件，構(gòu)建人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3（TGF-β3）的真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染大鼠前軟骨干細(xì)胞(PSCs)，以獲得組織工程的種子細(xì)胞。探討穩(wěn)定表達(dá)重組TGF-β3對(duì)前軟骨干細(xì)胞（PSCs）增殖及向成軟骨方向定向分化的誘導(dǎo)作用。通過(guò)將軟骨誘導(dǎo)活性的TGF-β3基因非共價(jià)結(jié)合于自組裝多肽凝膠組織工程支架基質(zhì)材料上，制備具有軟骨誘導(dǎo)活性的新型基因活性基質(zhì)材料（GAM），以促進(jìn)種子細(xì)胞定向分化。對(duì)

2、比基因強(qiáng)化組織工程的不同方法研究載基因介質(zhì)與轉(zhuǎn)基因介質(zhì)對(duì)成軟骨誘導(dǎo)分化的體外研究，來(lái)評(píng)價(jià)其成軟骨誘導(dǎo)作用。
　　 方法：
　　 (1)基因工程的方法重組構(gòu)建pcDNA3.1(+)-hTGF-β3 真核表達(dá)載體并鑒定：通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增編碼hTGF-β3的編碼序列（cds），在其啟動(dòng)子上游加X(jué)ho I酶切位點(diǎn)，終止子下游加BamH I酶切位點(diǎn)，雙酶切載體pcDNA3.1(+)和hTGF-β3 片段，回收后T4

3、DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂板孵育挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，酶切、測(cè)序鑒定。
　　 (2)免疫磁珠法分離純化大鼠前軟骨干細(xì)胞：在手術(shù)顯微鏡下（310 倍）鈍性分離大鼠La Croix 環(huán)，采用三步酶消化法獲得含有PSCs的混合細(xì)胞。48 小時(shí)后，按操作說(shuō)明采用免疫磁珠分選系統(tǒng)純化上述細(xì)胞，即可得到FGFR-3 陽(yáng)性細(xì)胞。將細(xì)胞種入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
　　 (3)納米級(jí)的高分子聚合物線性化的聚乙烯亞胺（PE

4、I）共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染：pcDNA3.1(+)-hTGF-β3與pcDNA3.1-EGFP，PEI和DNA混合的量的N/P 比5 左右，48 小時(shí)候終止轉(zhuǎn)染。
　　 (4)觀察和檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況：轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，收獲細(xì)胞。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR檢測(cè)TGF-β3表達(dá)情況。收集轉(zhuǎn)染后24hr，48hr，72hr，96hr，120hr時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用雙抗體夾心ELISA法，以TGF-β3純品制作標(biāo)準(zhǔn)

5、曲線，測(cè)定轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組各代細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β3 蛋白的濃度。
　　 (5)抗生素篩選穩(wěn)定表達(dá)TGF-β3 克?。?8h后終止轉(zhuǎn)染，更換含有G418的培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定篩選。至細(xì)胞陽(yáng)性克隆形成后，挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 (6)噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)增殖情況：將轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞按每孔5.0×103的密度接種至96孔板中，分別于0，24，48，72，96h 加入濃度為5mg/ml MTT 20μl，置培養(yǎng)箱避光

6、孵育4h，然后棄上清，加入150μl的DMSO。振蕩充分溶解后，在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)度吸光度值，并繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 (7)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染對(duì)PSCs增殖和DNA 合成的影響：收集第2 代細(xì)胞，分為未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組，預(yù)處理后，上機(jī)檢測(cè)，測(cè)定細(xì)胞周期，觀察G1 期、S 期、G2 期細(xì)胞各占的百分比。
　　 (8)qRT-PCR檢測(cè)成軟骨基因表達(dá)情況：：收獲轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄。使用GAPDH

7、作為內(nèi)參照，實(shí)用Sybr Green法進(jìn)行相對(duì)實(shí)時(shí)定量。
　　 相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)比較Ct 來(lái)確定。Y=2-ΔΔCt,ΔΔCt=ΔE-ΔC，ΔE=Ct轉(zhuǎn)染組-CtGAPDH,ΔC=Ct未轉(zhuǎn)染組-CtGAPDH。
　　 (9)免疫組化及western blot的方法比較轉(zhuǎn)染后目的基因和軟骨特異性標(biāo)志物表達(dá)的情況：取穩(wěn)定表達(dá)TGFβ3的PSCs和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞做爬片，用4 ℃固定液（丙酮：乙醇 1 ︰1）固定20min，免疫組化

8、，HE，番紅O等檢測(cè)。取轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，取20ug總蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，剪取相應(yīng)條帶，加入用脫脂奶粉配成的1︰200 兔抗大鼠Ⅱ型膠原抗體或1 ︰100的兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體的抗體稀釋液，4 ℃封閉孵育過(guò)夜，PBS 洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1︰2000)，37 ℃振蕩孵育1h，漂洗后采用化

9、學(xué)發(fā)光發(fā)檢測(cè)，于暗室中曝光后洗片，掃描，灰度分析。
　　 (10)用固相法合成KLD-12 多肽并通過(guò)高壓液相色譜及質(zhì)譜儀純化并鑒定；取0.5%（w/v）多肽在生理溶液條件自組裝成多肽凝膠裝物質(zhì)，將TGF-β3 質(zhì)粒與KLD-12 多肽間非共價(jià)鍵結(jié)合負(fù)載質(zhì)粒并檢測(cè)其DNA 釋放能力。
　　 （11）實(shí)驗(yàn)分四組，A組取轉(zhuǎn)染TGF-β3細(xì)胞與KLD-12混合，B組取PSCs細(xì)胞與載基因支架混合，C組取PSCs與KLD-12混

10、合，D組為KLD-12 支架。通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，qRT-PCR法檢測(cè)成軟骨基因表達(dá)情況Alcian Blue法檢測(cè)軟骨外基質(zhì)sGAG含量。
　　 結(jié)果:
　　 (1)重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切電泳，和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，共轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，RT-PCR和Elisa可以檢測(cè)到有目的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24h，上清液中TGF-β3含量即呈上升趨勢(shì)，在72h后逐漸下降。
　　 (2)hTG

11、F-β3 在分離純化的PSCs中穩(wěn)定表達(dá)。MTT結(jié)果顯示，2d內(nèi)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的增殖活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染組的增殖效率明顯高于未轉(zhuǎn)染組qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組軟骨特異的標(biāo)志物基因表達(dá)都有不同程度的上升（p<0.05）。免疫組化學(xué)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后PSCs細(xì)胞外基質(zhì)的染色增多并加深，并且出現(xiàn)軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)，II型膠原染色也加深。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組對(duì)軟骨表面標(biāo)志II

12、型膠原（collagen type II）表達(dá)明顯增高，TGF-β3的表達(dá)也顯著增高，灰度值測(cè)量顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 (3)KLD-12 多肽序列合成成功，其相對(duì)分子質(zhì)量為1 466.9；負(fù)載TGF-β3基因的自組裝肽凝膠支架的基因釋放DNA含量于3 d內(nèi)達(dá)高峰，2 周內(nèi)可維持在較高水平。
　　 (4)A組增殖能力始終要強(qiáng)于其他兩組，B組與C組之間的增殖能力差異在10d左右開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<

13、0.05）。A組，B組隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)軟骨標(biāo)志物基因上調(diào)明顯，與C組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），軟骨外基質(zhì)sGAG與DNA含量在A組，B組，C組之間的兩兩差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。暗室中曝光后洗片，掃描，灰度分析。
　　 (10)用固相法合成KLD-12 多肽并通過(guò)高壓液相色譜及質(zhì)譜儀純化并鑒定；取0.5%（w/v）多肽在生理溶液條件自組裝成多肽凝膠裝物質(zhì)，將TGF-β3 質(zhì)粒與KLD-12 多肽間非共價(jià)鍵結(jié)合負(fù)載質(zhì)粒并檢

14、測(cè)其DNA 釋放能力。
　　 （11）實(shí)驗(yàn)分四組，A組取轉(zhuǎn)染TGF-β3細(xì)胞與KLD-12混合，B組取PSCs細(xì)胞與載基因支架混合，C組取PSCs與KLD-12混合，D組為KLD-12 支架。通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，qRT-PCR法檢測(cè)成軟骨基因表達(dá)情況Alcian Blue法檢測(cè)軟骨外基質(zhì)sGAG含量。
　　 結(jié)論：
　　 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，正確構(gòu)建真核表達(dá)載體hTGF-β3的重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染P

15、SCs，為軟骨組織工程的的基因強(qiáng)化研究提供了新的備選基因及種子細(xì)胞。通過(guò)壓力篩選后，獲得的hTGF-β3基因強(qiáng)化的PSCs的細(xì)胞株，可以穩(wěn)定表達(dá)高效的hTGF-β3 蛋白，從而促進(jìn)PSCs的增殖并向成軟骨方向分化，為軟骨缺損的高效修復(fù)提供了新的手段。
　　 成功合成負(fù)載TGF-β3基因自組裝肽凝膠基質(zhì)材料，并進(jìn)行質(zhì)粒釋放動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，該材料可在2 周左右保持較高的質(zhì)粒釋放水平，有利與組織的修復(fù)?；驈?qiáng)化的基質(zhì)材料可以作為軟骨，骺板