氨甲?；偌t素的制備及其對過氧化氫損傷的SH-SY5Y細胞保護作用的觀察.pdf

1、研究背景：促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由腎臟分泌的，含有唾液酸的糖蛋白，以往認為它的主要生物學作用是能夠與EPO受體(EPOreceptor，EPOR)結(jié)合后促進紅系祖細胞分化為成熟的紅細胞從而增加循環(huán)中的紅細胞的數(shù)量，因此，EPO被廣泛應用于治療多種原因引起的貧血，如腎性貧血、新生兒貧血、癌性貧血等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPO及其受體還廣泛分布于各種非造血組織，例如心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等，能夠通過抑制細胞凋亡，減

2、少炎性因子分泌及炎癥細胞浸潤，促進新生血管生長等機制而發(fā)揮多種非造血作用，如神經(jīng)、心臟等的組織保護作用，所以被認為是一種全身性的保護性細胞因子。但是促紅素本身具有促進紅細胞增生的作用，可能會導致血液粘稠度增加，血流動力學發(fā)生改變而誘發(fā)血栓形成，因而限制了EPO的對于腦梗死等疾病的臨床應用。然而，促紅細胞生成素的衍生物，氨甲?；偌t細胞生成素(carbamylated EPO，CEPO)與促紅細胞生成素不同，CEPO既保留了EPO的神經(jīng)組

3、織保護作用，又不刺激骨髓造血系統(tǒng)，沒有促進紅細胞增生的作用。有學者發(fā)現(xiàn)在腎臟病變晚期的患者體內(nèi)尿素及其衍生物氰酸鹽等濃度增高后，可使EPO發(fā)生氨甲?；磻蒀EPO，使EPO的造血活性降低并最終加重病人貧血。隨后又有學者在體外用氰酸鉀與重組人促紅細胞生成素(recombinarlt human erythropoietin，rhEPO)共同孵育后使rhEPO中的賴氨酸氨甲?；?，得到CEPO，并通過動物實驗證實，CEPO與EPO不同，不

4、會影響動物的紅細胞比容，但對于腦梗死等動物模型仍具有抑制細胞凋亡及改善動物預后等神經(jīng)組織保護作用，且應用于脊髓損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、周圍神經(jīng)損傷、實驗性自身免疫性腦脊髓炎等動物模型后發(fā)現(xiàn)CEPO均具有相似的神經(jīng)保護作用，CEPO既保留了EPO的神經(jīng)保護作用，又去除了其促進紅細胞增生而誘發(fā)血栓形成等副作用。
　　 過氧化氫是機體代謝的產(chǎn)物，同時它也是一種活性氧，易透過細胞膜，與細胞內(nèi)的金屬離子反應形成高活性的氧自由基，導致一系列反

5、應，最終引起細胞的損傷甚至死亡，現(xiàn)已成為研究缺氧等所致的細胞氧自由基損傷的重要工具。采用體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞氧自由基損傷模型，可排除整體情況下缺氧伴發(fā)的酸中毒、高碳酸血癥等諸多因素的影響，且可以與動物實驗互補。
　　 SH-SY5Y細胞來源于人神經(jīng)母細胞瘤細胞，是一種分化程度較低的腫瘤細胞，該細胞具有明顯的軸突，其形態(tài)、生理和生化功能等與正常神經(jīng)細胞相似，最近十幾年逐漸被越來越多地應用于神經(jīng)病學實驗研究中。
　　 研究目的

6、：利用EPO與氰酸鉀發(fā)生氨甲?；磻苽銫EPO；觀察CEPO對過氧化氫損害的神經(jīng)母細胞瘤細胞的保護作用，并與相同劑量的EPO進行比較，觀察CEPO對神經(jīng)細胞的保護作用與EPO有無差異，并對其可能機制，如凋亡等進行探討及研究。
　　 研究方法：
　　 一、氨甲?；偌t素的制備與鑒定
　　 1、氨甲?；偌t素的制備先將EPO干粉50000 IU(0.5mg)與適量的硼酸鈉和氰酸鉀混勻，溫育23小時后透析。用考馬斯

7、亮藍G250法測定獲得的CEPO蛋白濃度。
　　 2、氨甲?；偌t素的鑒定取100IU的EPO及上述制得的CEPO，經(jīng)二硫赤蘚糖醇與碘化乙酰胺作用后，加至經(jīng)0.05 mmol/L碳酸氫胺和0.4 mol/L尿素溶液平衡的Hi Trap625柱，進樣后收集首柱1/3～1/2體積的洗脫液。用考馬斯亮藍G250法測定收集液體中的蛋白濃度。促紅素和上柱后的流出液各取100IU，分別加入0.4μ g Lys-c蛋白內(nèi)切酶(endoprot

8、einase Lys-C)，37℃孵育20小時，得其經(jīng)酶作用后的產(chǎn)物。將上述所有反應物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，加樣依次為：①Marker蛋白；②未經(jīng)酶解的EPO50IU；③EPO經(jīng)Lys-c蛋白內(nèi)切酶酶解后的產(chǎn)物15μ L；④EPO氨甲酰化后經(jīng)Lys-c蛋白內(nèi)切酶酶解后的產(chǎn)物15μ L；⑤EPO氨甲酰化后所得產(chǎn)物50IU。電泳結(jié)束后取出分離膠，用銀染方法對蛋白進行染色。
　　 二、CEPOX寸過氧化氫損

9、傷的SH-SY5Y細胞的保護作用的觀察及研究
　　 1、過氧化氫損傷模型的建立調(diào)節(jié)SH-SY5Y細胞密度后接種于6孔板，12小時后分別加入不同濃度的過氧化氫(0、50、200、300、400μ mol/L)，12小時后收集細胞，用噻唑蘭(methylthiazoletetrazolium，MTT)法測細胞存活率，根據(jù)MTT值判定實驗所需采用的過氧化氫濃度。
　　 2、實驗分組根據(jù)選用的不同的過氧化氫濃度，將細胞分為2大組

10、進行實驗，第1大組采用過氧化氫濃度為300μ mol幾，又分為以下幾個小組：①對照組，即過氧化氫組；②CEPO組；③EPO組；以上各組加入含300μ mol/L過氧化氫培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時后，更換為含相應試劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后進行下一步試驗。第2大組為采用400μ mol幾過氧化氫，余分組同第1大組。
　　 3、細胞形態(tài)的觀察待培養(yǎng)結(jié)束后在相差倒置顯微鏡下觀察各不同分組細胞的形態(tài)，尤其是SH-SY5Y細胞的突起，胞體形態(tài)等。<

11、br>　　 4、MTT法測定細胞活性將各組SH-SY5Y細胞結(jié)束培養(yǎng)后，先后加入MTT及二甲基亞砜作用后，再于自動免疫酶標儀測波長為570nm處的吸光度。該結(jié)果可反應細胞的存活率。
　　 5、乳酸脫氫酶的測定以損傷的SH-SY5Y細胞LDH的釋放量作為定量評價細胞損傷的指標。乳酸脫氫酶釋放量的測定方法依照乳酸脫氫酶測量試劑盒的說明書操作。細胞損傷時乳酸脫氫酶會釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中乳酸脫氫酶的多少可反映出細胞的損傷程度。

12、
　　 6、Annexin V/PI雙染色檢測SH-SY5Y細胞的凋亡各組細胞按不同的方法進行培養(yǎng)，待結(jié)束培養(yǎng)后，加入凋亡試劑處理，再用PBS溶液將其洗滌并處理成單個細胞，在流式細胞儀上檢測細胞的凋亡率。
　　 7、熒光定量RT-PCR檢測Bcl-2及細胞半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-8的表達各組細胞結(jié)束培養(yǎng)后，用Trizol試劑提取細胞總RNA，RT-PCR按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。
　　

13、 研究結(jié)果：
　　 一、氨甲酰基促紅素的制備與鑒定
　　 經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結(jié)果顯示，經(jīng)Lys-C蛋白內(nèi)切酶酶切后的EPO發(fā)生了明顯降解，相對分子質(zhì)量約為3.4×104的EPO譜帶完全消失，取而代之的是相對分子質(zhì)量大約為1.4×104的蛋白譜帶，但EPO經(jīng)過氰酸鉀作用后并上柱的流出液，不論是經(jīng)Lys-C蛋白內(nèi)切酶酶切的，還是未經(jīng)酶切的，均僅為相對分子質(zhì)量約為3.4×104的單一條帶。特別是

14、經(jīng)蛋白內(nèi)切酶酶切的EPO氨甲?；蟮漠a(chǎn)物中未見到降解肽段，即未見到其它相對分子質(zhì)量小的區(qū)域有條帶，說明EPO的氨甲?；磻滞耆?，幾乎所有的EPO均轉(zhuǎn)化為CEPO。
　　 二、CEPO對過氧化氫損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用的觀察及研究
　　 1、過氧化氫對SH-SY5Y的MTT結(jié)果的影響結(jié)果顯示，隨著過氧化氫濃度的增加，MTT的值呈下降趨勢。根據(jù)該結(jié)果，我們分別選用濃度為300mol/L、400μ mol/L的

15、過氧化氫進行下一步實驗。
　　 2、CEPO對細胞形態(tài)的影響 SH-SY5Y細胞正常培養(yǎng)，不加任何處理時，細胞形態(tài)為多邊形，胞體較大，胞核飽滿，大部分細胞有突起，加用過氧化氫作用后，細胞形態(tài)變得不規(guī)整，胞核萎縮，細胞突起基本消失；加用不同濃度的CEPO作用后，細胞形態(tài)較單獨過氧化氫作用時規(guī)整，部分細胞可見到神經(jīng)突起恢復，且隨著CEPO的單位濃度的增加，可見到細胞突起的數(shù)量增加，胞體形態(tài)變得規(guī)整。且與EPO組相比，CEPOS對細胞

16、形態(tài)的影響與相同劑量的EPO是無明顯差別的。
　　 3、CEPO對細胞存活率的作用結(jié)果可見，對照組細胞存活率較低，而與對照組比較，CEPO、EPO組的細胞存活率明顯上升，P值小于0.01；且隨著CEPO、EPO濃度的增加，細胞存活率呈上升趨勢，但當CEPO、EPO濃度由80IU/mL上升至100IU/mL時，細胞存活率的上升趨勢變得不明顯；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性，提示二者對細胞存活率的影響無明顯差異。<

17、br>　　 4、CEPO對細胞乳酸脫氫酶的影響細胞損傷時乳酸脫氫酶會釋放入培養(yǎng)液中，故其上清液中乳酸脫氫酶的多少可反映出細胞的損傷程度。結(jié)果顯示，過氧化氫可造成SH-SY5Y細胞損傷，使乳酸脫氫酶的值升高，而CEPO與EPO則能明顯減低乳酸脫氫酶的溢出，各組與對照組相比，P值均小于0.01；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性，P值均大于0.01，提示CEPO對乳酸脫氫酶的溢出率的影響與EPO基本相同。
　　 5、

18、CEPO對細胞凋亡率的影響結(jié)果顯示，過氧化氫可造成SH-SY5Y細胞凋亡，CEPO與EPO則能明顯減低細胞的凋亡率；且隨著CEPO、EPO濃度的增加，細胞凋亡率呈下降趨勢，各組與對照組相比，P值均小于0.01；但當CEPO、EPO濃度達到100IU/mL時，細胞凋亡的下降趨勢變得不明顯，提示CEPO及EPOS對細胞凋亡的抑制作用已達頂峰；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性，說明CEPO對細胞凋亡率的抑制與EPO的的基本相同

19、。
　　 6、CEPO對細胞Bcl-2及Caspase-8的mRNA表達的影響結(jié)果顯示，與對照組相比，EPO與CEPO組的Bcl-2 mRNA的表達是增高的，而Caspase-8 mRNA的表達是降低的，各組與對照組相比，P值均小于0.01；且隨著CEPO、EPO濃度的增加，這種變化趨勢更加明顯，但當CEPO、EPO濃度由80IU/mL達到100IU/mL時，這種變化趨勢變得不明顯，說明CEPO及EPO對Bcl-2及Caspas

20、e-8的mRNA表達的影響已達到頂峰；相同濃度的CEPO組與EPO組相比，差異無顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1、利用EPO與氰酸鉀共同孵育的方法制備出氨甲?；偌t素并利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定，結(jié)果表明，EPO經(jīng)Lys-C蛋白內(nèi)切酶酶切后全部降解，而EPO經(jīng)氨甲?；髣t沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶切后降解的產(chǎn)物，表明CEPO不僅制備成功，且所獲得的CEPO具有極高的純度。
　　 2、經(jīng)過氧化氫作用后，SH-SY5Y

21、細胞損傷明顯，當經(jīng)不同濃度的CEPO和EPO作用后，細胞的存活率隨著CEPO及EPO濃度的增加而上升，乳酸脫氫酶的值隨著CEPO及EPO濃度的增加而下降，證明CEPO及EPO對氧自由基損傷的SH-SY5Y細胞具有明顯的保護作用，這種對細胞的保護作用是隨著濃度的增加而增強的。同時，對于本實驗中所采用的不同濃度的過氧化氫，CEPO及EPO均起到了一定程度的保護作用，提示即使對于氧自由基損傷程度較重的SH-SY5Y細胞，CEPO仍具有明顯的保

22、護作用，且CEPO對SH-SY5Y細胞的保護作用與EPO是基本相同的。
　　 3、經(jīng)流式細胞儀對Annexin V/PI進行檢測，實驗結(jié)果表明，經(jīng)過CEPO及EPO的作用后，細胞的凋亡率降低，且隨著CEPO及EPO濃度的增加凋亡率降低得更加明顯，提示對凋亡的抑制參與了該保護作用。400μ mol/L濃度的過氧化氫組的凋亡率下降的程度與300μ mol/L濃度組基本相同，提示即使是對于氧自由基損傷程度較重的神經(jīng)母細胞瘤細胞，不同濃

23、度的CEPO也發(fā)揮了其較好的抗凋亡作用。CEPO組與EPO組相比，無明顯的差異，提示CEPO與EPO的抗凋亡作用是基本相同的。
　　 4、采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對Bcl-2及caspase-8進行檢測，實驗結(jié)果表明，經(jīng)過CEPO及EPO的作用后，caspase-8均較對照組降低，而Bcl-2則升高，隨著CEPO及EPO濃度的增加而變化得更加明顯，但在濃度從80IU/mL上升至100IU/mL時，變化程度則變得不明顯，提示C

24、EPO的抗凋亡作用可通過Bcl-2基因的調(diào)控及對caspase-8進行抑制作用而實現(xiàn)。400μ mol/L濃度的過氧化氫組的凋亡率下降的程度與300μ mol幾濃度基本相同，提示即使是對于損傷程度較重的神經(jīng)母細胞瘤細胞，CEPO也發(fā)揮了其較好的抗凋亡作用。CEPO組與EPO組相比，無明顯的差異，提示CEPO對Bcl-2及caspase-8的調(diào)節(jié)作用與EPO是基本相同的。
　　 意義：本研究首次對氨甲?；偌t素對氧自由基損傷的神經(jīng)