雌激素誘導Nrp1+T細胞的產生及其抗原特異性免疫調節(jié)功能研究.pdf

1、第一部分 Nrp1+T細胞的調節(jié)功能
　　 目的:
　　 探討Nrp1在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中的作用；探討Nrp1是否通過其配體VEGF165及SEMA3A在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中發(fā)揮作用；以na(i)veCD4+CD25+調節(jié)性T細胞做陽性對照,探討分選后Nrp1+T細胞的調節(jié)功能。
　　 方法:
　　 (1)采用流式細胞術觀察單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中,反應細胞活化對其細胞表面Nrp1+表達的

2、影響。
　　 (2)采用AlamarBlueTM法檢測Nrp1、VEGF165、SEMA3A的功能阻斷抗體對單向淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中反應細胞增殖的影響。
　　 (3)采用流式細胞術分選naive CD4+CD25+調節(jié)性T細胞和Nrp1+T細胞,對比觀察其在共刺激信號下的增殖情況；其對反應細胞增殖、TGF-β表達、IL-10表達的影響；其對小鼠同種異基因皮膚移植模型移植皮膚存活的影響。
　　 結果:
　　

3、 (1)當T細胞活化后,其表面Nrp1的表達由(2.34±0.21)％下降到(1.37±0.14)％。
　　 (2)Nrp1的阻斷抗體可以顯著地抑制淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中反應細胞的增殖,增殖比率為對照組的(90.30±1.725)％,Nrp1的兩種配體VEGF165和Sema3A的阻斷抗體也可以抑制淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中反應細胞的增殖,增殖率分別為(95.58±2.104)％和(95.48±1.551)％。
　　 (3

4、)Nrp1+T細胞在CD3/CD28共刺激信號刺激下,增殖指數為51.53±0.50,與CD4+CD25+調節(jié)性T細胞相當50.44+1.12,P>0.05。
　　 (4)Nrp1+T細胞可以抑制反應細胞的增殖,同時促進反應細胞分泌TGF-β(118.1±1.91 VS23.57±1.45 pg/ml)和IL-10(1650±111.6 VS110.6±7.61pg/ml)。
　　 (5)Nrp1+T細胞可以顯著延長同種

5、異基因小鼠皮膚移植模型移植皮膚存活時間(19.1±0.96)days VS.(12.1±1.084)days。
　　 結論:
　　 (1)Nrp1在免疫反應中發(fā)揮重要作用,但已知的兩種配體VEGF165和SEMA3A對Nrp1在免疫反應中的功能無明顯影響。
　　 (2)Nrp1+T細胞具有與傳統意義上CD4+CD25+調節(jié)T細胞相似的免疫調節(jié)功能。
　　 第二部分雌激素誘導Nrp1+T細胞的產生及其抗原特

6、異性免疫調節(jié)功能的研究
　　 目的:
　　 探討雌激素在小鼠單向淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中的作用；探討雌激素濃度與反應細胞CD3+Nrp1+亞群表達的關系；探討妊娠濃度雌激素誘導產生Nrp1+T細胞的供體抗原特異性免疫調節(jié)功能。
　　 方法:
　　 (1)在小鼠單向淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中加入梯度濃度雌激素(10-5M～10-9M),在細胞培養(yǎng)結束后,采用AlamarBlueTM法檢測梯度濃度雌激素對體系中反應

7、細胞增殖的影響；采用流式細胞術檢測梯度濃度雌激素對反應細胞CD3+Nrp1+亞群變化的影響。
　　 (2)分離Balb/c小鼠脾淋巴細胞,經絲裂霉素處理后標記熒光染料CFSE,后與C57小鼠脾淋巴細胞在高濃度E2(終濃度為10-7)的刺激下于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后,應用流式細胞術檢測CFSE陰性細胞(即C57小鼠脾淋巴細胞)CD3+Nrp1+細胞亞群的比率變化,同時分選該群細胞。
　　 (3)在C57孕鼠尾

8、靜脈注射經絲裂霉素處理后的Balb/c小鼠脾淋巴細胞懸液(106個,200μl),連續(xù)注射5天后,分離該孕鼠脾淋巴細胞懸液,應用流式細胞術檢測CD3+Nrp1+細胞亞群的比率變化,同時分選該群細胞。
　　 (4)將妊娠濃度雌激素誘導產生的Nrp1+T細胞作為調節(jié)細胞,再次與初次接觸的抗原提呈細胞(BALB/c)及第三方抗原提呈細胞(C3H/He)共培養(yǎng),觀察其對反應細胞(C57BL/6)增殖的影響。
　　 結果:

9、　　 (1)只有生理濃度的雌激素可以促進反應細胞的增殖,隨著雌激素濃度的升高淋巴細胞增殖比率逐漸降低,且存在劑量依賴性。反應細胞CD3+Nrp1+亞群的表達隨著雌激素濃度的升高先升高,在妊娠濃度濃度(10-7 M)時達到高峰,由(1.22±0.10)％增至(2.18±0.15)％,然后降低。
　　 (2)妊娠濃度雌激素體外誘導和體內誘導均可使反應細胞CD3+Nrp1+的表達比率上調,但以體外誘導效果更明顯。體內誘導VS.體外誘

10、導為(3.860±0.521)％vs.(2.409±0.289)％。
　　 (3)使用流式細胞術分選Nrp1+T細胞,可以達到較高的純度(>95％)。
　　 (4)妊娠濃度雌激素體外誘導產生的Nrp1+T細胞具有供體抗原特異性特征,其對供者抗原刺激引起反應細胞增殖的抑制能力顯著高于第三方抗原刺激引起的反應細胞增殖,增殖比率為(29.83±5.60％vs.(54.53±4.07)％,p<0.05。
　　 (5)孕鼠

11、體內誘導產生的Nrp1+T細胞具有供體抗原特異性特征,其對供者抗原刺激引起反應細胞增殖的抑制能力顯著高于第三方抗原刺激引起的反應細胞增殖,增殖比率為(37.91±3.72)％vs.(56.53±4.63)％,p<0.01。
　　 結論:
　　 (1)生理濃度的雌激素可以促進淋巴細胞的增殖,但隨著雌激素濃度的增高細胞增殖逐漸被抑制。
　　 (2)CD3+Nrp1+細胞的比例在妊娠濃度雌激素刺激時達到峰值。