雌激素誘導(dǎo)Nrp1+T細胞的產(chǎn)生及其抗原特異性免疫調(diào)節(jié)功能研究.pdf

1、第一部分 Nrp1+T細胞的調(diào)節(jié)功能
　　 目的:
　　 探討Nrp1在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中的作用；探討Nrp1是否通過其配體VEGF165及SEMA3A在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中發(fā)揮作用；以na(i)veCD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞做陽性對照,探討分選后Nrp1+T細胞的調(diào)節(jié)功能。
　　 方法:
　　 (1)采用流式細胞術(shù)觀察單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系中,反應(yīng)細胞活化對其細胞表面Nrp1+表達的

2、影響。
　　 (2)采用AlamarBlueTM法檢測Nrp1、VEGF165、SEMA3A的功能阻斷抗體對單向淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中反應(yīng)細胞增殖的影響。
　　 (3)采用流式細胞術(shù)分選naive CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和Nrp1+T細胞,對比觀察其在共刺激信號下的增殖情況；其對反應(yīng)細胞增殖、TGF-β表達、IL-10表達的影響；其對小鼠同種異基因皮膚移植模型移植皮膚存活的影響。
　　 結(jié)果:
　　

3、 (1)當(dāng)T細胞活化后,其表面Nrp1的表達由(2.34±0.21)％下降到(1.37±0.14)％。
　　 (2)Nrp1的阻斷抗體可以顯著地抑制淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中反應(yīng)細胞的增殖,增殖比率為對照組的(90.30±1.725)％,Nrp1的兩種配體VEGF165和Sema3A的阻斷抗體也可以抑制淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中反應(yīng)細胞的增殖,增殖率分別為(95.58±2.104)％和(95.48±1.551)％。
　　 (3

4、)Nrp1+T細胞在CD3/CD28共刺激信號刺激下,增殖指數(shù)為51.53±0.50,與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞相當(dāng)50.44+1.12,P>0.05。
　　 (4)Nrp1+T細胞可以抑制反應(yīng)細胞的增殖,同時促進反應(yīng)細胞分泌TGF-β(118.1±1.91 VS23.57±1.45 pg/ml)和IL-10(1650±111.6 VS110.6±7.61pg/ml)。
　　 (5)Nrp1+T細胞可以顯著延長同種

5、異基因小鼠皮膚移植模型移植皮膚存活時間(19.1±0.96)days VS.(12.1±1.084)days。
　　 結(jié)論:
　　 (1)Nrp1在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,但已知的兩種配體VEGF165和SEMA3A對Nrp1在免疫反應(yīng)中的功能無明顯影響。
　　 (2)Nrp1+T細胞具有與傳統(tǒng)意義上CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞相似的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 第二部分雌激素誘導(dǎo)Nrp1+T細胞的產(chǎn)生及其抗原特

6、異性免疫調(diào)節(jié)功能的研究
　　 目的:
　　 探討雌激素在小鼠單向淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中的作用；探討雌激素濃度與反應(yīng)細胞CD3+Nrp1+亞群表達的關(guān)系；探討妊娠濃度雌激素誘導(dǎo)產(chǎn)生Nrp1+T細胞的供體抗原特異性免疫調(diào)節(jié)功能。
　　 方法:
　　 (1)在小鼠單向淋巴細胞混合培養(yǎng)體系中加入梯度濃度雌激素(10-5M～10-9M),在細胞培養(yǎng)結(jié)束后,采用AlamarBlueTM法檢測梯度濃度雌激素對體系中反應(yīng)

7、細胞增殖的影響；采用流式細胞術(shù)檢測梯度濃度雌激素對反應(yīng)細胞CD3+Nrp1+亞群變化的影響。
　　 (2)分離Balb/c小鼠脾淋巴細胞,經(jīng)絲裂霉素處理后標記熒光染料CFSE,后與C57小鼠脾淋巴細胞在高濃度E2(終濃度為10-7)的刺激下于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測CFSE陰性細胞(即C57小鼠脾淋巴細胞)CD3+Nrp1+細胞亞群的比率變化,同時分選該群細胞。
　　 (3)在C57孕鼠尾

8、靜脈注射經(jīng)絲裂霉素處理后的Balb/c小鼠脾淋巴細胞懸液(106個,200μl),連續(xù)注射5天后,分離該孕鼠脾淋巴細胞懸液,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測CD3+Nrp1+細胞亞群的比率變化,同時分選該群細胞。
　　 (4)將妊娠濃度雌激素誘導(dǎo)產(chǎn)生的Nrp1+T細胞作為調(diào)節(jié)細胞,再次與初次接觸的抗原提呈細胞(BALB/c)及第三方抗原提呈細胞(C3H/He)共培養(yǎng),觀察其對反應(yīng)細胞(C57BL/6)增殖的影響。
　　 結(jié)果:

9、　　 (1)只有生理濃度的雌激素可以促進反應(yīng)細胞的增殖,隨著雌激素濃度的升高淋巴細胞增殖比率逐漸降低,且存在劑量依賴性。反應(yīng)細胞CD3+Nrp1+亞群的表達隨著雌激素濃度的升高先升高,在妊娠濃度濃度(10-7 M)時達到高峰,由(1.22±0.10)％增至(2.18±0.15)％,然后降低。
　　 (2)妊娠濃度雌激素體外誘導(dǎo)和體內(nèi)誘導(dǎo)均可使反應(yīng)細胞CD3+Nrp1+的表達比率上調(diào),但以體外誘導(dǎo)效果更明顯。體內(nèi)誘導(dǎo)VS.體外誘

10、導(dǎo)為(3.860±0.521)％vs.(2.409±0.289)％。
　　 (3)使用流式細胞術(shù)分選Nrp1+T細胞,可以達到較高的純度(>95％)。
　　 (4)妊娠濃度雌激素體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的Nrp1+T細胞具有供體抗原特異性特征,其對供者抗原刺激引起反應(yīng)細胞增殖的抑制能力顯著高于第三方抗原刺激引起的反應(yīng)細胞增殖,增殖比率為(29.83±5.60％vs.(54.53±4.07)％,p<0.05。
　　 (5)孕鼠

11、體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Nrp1+T細胞具有供體抗原特異性特征,其對供者抗原刺激引起反應(yīng)細胞增殖的抑制能力顯著高于第三方抗原刺激引起的反應(yīng)細胞增殖,增殖比率為(37.91±3.72)％vs.(56.53±4.63)％,p<0.01。
　　 結(jié)論:
　　 (1)生理濃度的雌激素可以促進淋巴細胞的增殖,但隨著雌激素濃度的增高細胞增殖逐漸被抑制。
　　 (2)CD3+Nrp1+細胞的比例在妊娠濃度雌激素刺激時達到峰值。