結(jié)核病患者結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究.pdf

1、結(jié)核病是嚴(yán)重威脅人類健康的最重要傳染病之一。據(jù)WHO 估計(jì)，2007年全世界每年新感染結(jié)核病患者927萬(wàn)人，其中有410萬(wàn)人是痰菌陽(yáng)性結(jié)核病患者。單2007年死亡的結(jié)核病患者人數(shù)高達(dá)177.6萬(wàn)，其中合并HIV 感染的結(jié)核病患者死亡人數(shù)是45.6萬(wàn)。結(jié)核分枝桿菌感染人數(shù)眾多，但只有5％-10％的感染者發(fā)病。這說(shuō)明結(jié)核病患者自身免疫功能異常是結(jié)核病發(fā)生、發(fā)展的重要原因。近年來(lái)由于耐多藥結(jié)核（MDR-TB）和嚴(yán)重耐藥結(jié)核（XDR-TB）病例

2、的增加，現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物難以滿足治療需求，導(dǎo)致了一定比例的難治肺結(jié)核。在此背景下，結(jié)核病免疫防治的重要性進(jìn)一步凸顯出來(lái)。通過(guò)研究分析結(jié)核病患者免疫功能的異常的機(jī)制，為結(jié)核病免疫防治尋找新的治療及藥物作用靶點(diǎn)，研制新型結(jié)核病疫苗和建立有效的疫苗免疫評(píng)估方法是目前結(jié)核病防治工作的重要突破口。
　　 抗結(jié)核保護(hù)性免疫主要依賴CD4+和CD8+T細(xì)胞。CD4+T 數(shù)量減少及功能異常是艾滋病發(fā)病的主要機(jī)制，而艾滋患者對(duì)結(jié)核病高度易感，證明

3、了CD4+T細(xì)胞免疫在抗結(jié)核免疫中的關(guān)鍵作用。CD4基因缺陷小鼠雖然在結(jié)核分枝桿菌感染早期抵抗力顯著降低，但中后期抗結(jié)核免疫力與正常小鼠相似，提示CD8+T細(xì)胞在結(jié)核免疫保護(hù)中也發(fā)揮了非常重要的作用。
　　 為了研究結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，我們使用CD154(CD40L)作為抗原特異性CD4+T細(xì)胞的激活標(biāo)志，建立了通過(guò)結(jié)核抗原特異性刺激后CD4及CD154的表達(dá)確定結(jié)核抗原特異性CD4+T細(xì)胞的研究方法，該方法不同于

4、以往常用的四聚體(tetramers)技術(shù)和細(xì)胞因子檢測(cè)的方法，不需要知道被檢測(cè)個(gè)體的MHC 類型以及事先篩選適合的抗原多肽；完全不依賴于T細(xì)胞的細(xì)胞因子檢測(cè)。
　　 CD27是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，在效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的分化和功能中發(fā)揮了重要作用。我們對(duì)肺結(jié)核病患者抗原特異性CD4+T細(xì)胞CD27的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，與PPD 試驗(yàn)陽(yáng)性的健康對(duì)照者相比，結(jié)核病患者的CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)

5、胞的比例顯著降低(P=0.032)。與菌陽(yáng)初治結(jié)核病患者(P=0.008)及健康對(duì)照者(P=0.005)相比，久治不愈的肺結(jié)核病患者CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞的比例顯著降低；但菌陽(yáng)初治結(jié)核病患者與健康對(duì)照者相比，CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞的比例沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞與CD27-抗原特異性CD4+T細(xì)胞相比，能表達(dá)更高的Ki-67，說(shuō)明其具有更強(qiáng)的增殖能力。
　　 CD27+抗原特異性C

6、D4+T細(xì)胞與CD27-抗原特異性CD4+T細(xì)胞相比，能產(chǎn)生IFN-γ的比例更高。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析表明，CD27的表達(dá)與年齡沒(méi)有明顯相關(guān)性；對(duì)CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞的比例與肺結(jié)核病患者臨床資料進(jìn)行二元邏輯回歸分析表明：CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞的比例降低與久治不愈的肺結(jié)核呈顯著相關(guān)(P=0.002, odds ratio=19.6)。與分析的其余臨床資料(患者的性別、年齡、痰菌培養(yǎng)結(jié)果，是否有肺空洞，結(jié)核性胸膜炎，

7、支氣管結(jié)核)均無(wú)顯著相關(guān)性?？傊?，久治不愈的肺結(jié)核患者的CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞與初治肺結(jié)核病患者及健康對(duì)照相比明顯減少。邏輯回歸分析顯示：CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞百分比與久治不愈的肺結(jié)核密切相關(guān)。該研究提示可將CD27+抗原特異性CD4+T細(xì)胞作為結(jié)核病防護(hù)及臨床治療效果的監(jiān)控靶點(diǎn)，對(duì)耐藥結(jié)核病診斷及治療起到預(yù)警作用，還可用于結(jié)核病患者免疫功能的評(píng)估的免疫學(xué)分子標(biāo)識(shí)，通過(guò)評(píng)估及時(shí)采用免疫調(diào)節(jié)治療，達(dá)到提高治療效果的

8、目的。
　　 記憶T細(xì)胞(memory T cells)來(lái)源于初始T細(xì)胞(na?ve Tcells)。初始T細(xì)胞在抗原刺激下，迅速擴(kuò)增，分化為效應(yīng)T細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞免疫的功能；部分細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞。記憶T細(xì)胞對(duì)特異性抗原有記憶能力，壽命長(zhǎng)，可在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活并自我更新，當(dāng)再次遇到相同抗原后，可產(chǎn)生更快、更強(qiáng)和更有效的二次免疫反應(yīng)。這是因?yàn)橛洃汿細(xì)胞與初始T細(xì)胞相比，需要抗原的濃度低，更容易被抗原激活，對(duì)共刺激分子的依賴性較低。記

9、憶T細(xì)胞是機(jī)體預(yù)防細(xì)胞內(nèi)病原菌再次感染的基礎(chǔ)，誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞產(chǎn)生是高效疫苗必備的條件。
　　 根據(jù)CD45RA和CCR7表面標(biāo)記，可將CD8+記憶T細(xì)胞可分為CD45RA?
　　 CCR7+TCM（centrAlmemory T cell，中央記憶T細(xì)胞），CD45RA?
　　 CCR7
　　 ?
　　 TEM （effector memory T cell，效應(yīng)記憶T細(xì)胞）和CD45RA+CCR

10、7?
　　 TEMRA （RA+effector memory T cell，RA 陽(yáng)性效應(yīng)記憶T細(xì)胞），其中TCM和TEMRA 均為效應(yīng)記憶T細(xì)胞。以往研究顯示，抗原特異性TEMRA表達(dá)高水平的顆粒酶，可以直接溶解結(jié)核分枝桿菌寄生的巨噬細(xì)胞，抑制結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的增殖?？筎NF免疫治療導(dǎo)致的結(jié)核病發(fā)病率顯著增加可能與TEMRA 數(shù)量下降密切相關(guān)。這些研究提示，TEMRA在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮了非常重要的作用。到目前為止，對(duì)結(jié)核分

11、枝桿菌抗原特異性記憶T細(xì)胞亞群在抗結(jié)核免疫中作用的了解還非常有限。
　　 本研究對(duì)24例活動(dòng)性肺結(jié)核病患者及22例潛伏感染者的CD8+記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生及分布特性進(jìn)行了初步研究，建立了基于CD107a為分子標(biāo)識(shí)的結(jié)核抗原特異性CD8+T細(xì)胞檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)24例活動(dòng)性肺結(jié)核病患者及22例潛伏感染者的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，與潛伏感染人群相比，活動(dòng)性肺結(jié)核病患者CD45RA 陽(yáng)性CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞(CD8+TEMRA)亞群比例顯著增加(活

12、動(dòng)性肺結(jié)核病患者59.94±3.87％，潛伏感染者46.65±2.88％，P=0.0203)，活動(dòng)性肺結(jié)核病患者CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD8+TEM）
　　 亞群分布頻率顯著降低(活動(dòng)性肺結(jié)核病患者38.14±3.87％，潛伏感染者52.34±
　　 2.95％，P=0.0142)。我們推測(cè)：活動(dòng)性肺結(jié)核病患者與潛伏感染者抗原特異性CD8+效應(yīng)記憶T淋巴細(xì)胞亞群的比例存在明顯差異可能與體內(nèi)抗原刺激的程度及特異細(xì)胞免疫應(yīng)

13、答反應(yīng)相關(guān)。該結(jié)果為進(jìn)一步研制新型高效的結(jié)核病疫苗和建立有效的疫苗免疫評(píng)估方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 髓系抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群未成熟髓系細(xì)胞（immature myeloid cells, IMCs)，該群細(xì)胞在正常情況下可分化為樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，DCs)、巨噬細(xì)胞和(或)粒細(xì)胞。研究顯示MDSCs 具有抑制天然及獲得性細(xì)胞的功能。

14、現(xiàn)已證明，在一些腫瘤、感染及自身免疫疾病等病理情況下，MDSCs的數(shù)量和比例顯著增加。但到目前為止，結(jié)核病患者外周血中的MDSCs的狀況還不清楚。
　　 本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核病患者、潛伏感染者的髓系抑制性細(xì)胞(MDSCs)的產(chǎn)生及分布特性進(jìn)行了初步研究。
　　 通過(guò)對(duì)78例活動(dòng)性肺結(jié)核病患者、30例潛伏感染者及66例健康人的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性結(jié)核病患者CD14-HLA-DR-CD33+CD11b high