重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)基因修飾樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答.pdf

1、目的/背景：丙型肝炎病毒(HCV)感染可導(dǎo)致肝硬化和肝癌，是危害生命健康的感染性疾病。藥物治療既昂貴又容易造成嚴(yán)重不良反應(yīng)。因HCVRNA病毒抗原變異性大，因此研制可預(yù)防并清除病毒的強(qiáng)而有效的多種表位特異性的新型免疫疫苗具有重要的臨床意義。大量研究事實(shí)顯示以腺病毒為載體基因修飾樹突狀細(xì)胞是免疫治療領(lǐng)域極有前景的新型疫苗。該疫苗可在腫瘤和感染性疾病模型誘導(dǎo)抗原特異性體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞可由腺病毒或活化因子激活成熟，表達(dá)MHCⅡ類

2、分子和共刺激分子，促進(jìn)IL-12分泌，作用于效應(yīng)細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1亞型轉(zhuǎn)化。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3區(qū)氨基酸序列高度保守，NS3特異性T輔助性細(xì)胞應(yīng)答與急性感染后的病毒清除密切相關(guān)，此種反應(yīng)的缺失會(huì)導(dǎo)致病毒的持續(xù)存在及慢性肝炎。最近的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)接種表達(dá)HCV核心抗原E1的樹突狀細(xì)胞所誘導(dǎo)的CD4+andCD8+T細(xì)胞應(yīng)答弱于表達(dá)NS3抗原的樹突狀細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。而且研究事實(shí)表明，無論NS3DNA或表達(dá)NS3的重組腺病毒疫苗均可激發(fā)較

3、強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本課題組研究發(fā)現(xiàn)多肽或蛋白沖擊的樹突狀細(xì)胞也可誘導(dǎo)有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。然而迄今未見對(duì)腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3特異性細(xì)胞及體液免疫反應(yīng)的報(bào)道。因此本研究將構(gòu)建樹突狀細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)疫苗，采用初次/加強(qiáng)免疫接種法，在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因和Babl/c兩種小鼠動(dòng)物體內(nèi)研究并比較樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的HCVNS3基因疫苗和蛋白沖擊疫苗的免疫作用，通過檢測(cè)抗NS3IgG，IgG1、IgG2

4、a抗體，NS3特異性IFN-γ分泌型T細(xì)胞反應(yīng)，以及T細(xì)胞因子水平，確定最佳免疫疫苗，免疫治療方式和途徑。 方法： 1、編碼HCVNS3基因重組腺病毒(AdNS3)的構(gòu)建。HCVH77株NS3片段PCR克隆至pcDNA3.1/V5-His-Topo載體，并在HindⅢ/XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)亞克隆至pAdTrackCMV轉(zhuǎn)移載體。僅表達(dá)綠色熒光蛋白的腺病毒(AdGFP)為陰性對(duì)照組。293細(xì)胞擴(kuò)增病毒，氯化銫密度梯度超速

5、離心法及薄膜透析純化病毒。 2、重組腺病毒滴度和基因鑒定及蛋白表達(dá)空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度，PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)目的基因，WESTERNBLOT法測(cè)定蛋白表達(dá)。 3、分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞從小鼠脛骨分離提取骨髓，細(xì)胞懸液靜置12小時(shí)后，分離貼壁細(xì)胞，加入GM-CSF和IL-4繼續(xù)培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察到樹突狀細(xì)胞形態(tài)變化。 4、編碼HCVNS3或GFP蛋白的重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞。以感染率(MOI)10

6、0(3×108pfu/106DC/孔)的腺病毒感染培養(yǎng)7天的樹突狀細(xì)胞。一小時(shí)后，加入E.coli-LPS及完全營(yíng)養(yǎng)液調(diào)節(jié)DC終濃度至1×106～2×106cells/ml。48h后收獲細(xì)胞，清洗除去病毒殘液以備注射用。另設(shè)蛋白對(duì)照組(DC-rNS3)，即將純化重組HCVNS3蛋白與DC共育，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，注射前洗滌并收集細(xì)胞，同量免疫接種備用。 5、FACS和WESTERNBLOT方法檢測(cè)樹突狀細(xì)胞表面抗原及

7、細(xì)胞蛋白表達(dá)率。2×105細(xì)胞在4℃條件下分別與含0.5％小牛血清(BSA)PBS稀釋的FITC標(biāo)記的抗CD11c抗體、PE標(biāo)記的抗CD86和抗MHCclassⅡ(I-Ad)抗體共育30min。洗滌后于FACStar流式細(xì)胞儀，CellQuest軟件分析測(cè)定細(xì)胞表面抗原。NS3蛋白表達(dá)或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率采用WESTERNBLOT方法測(cè)定。12％SDS-PAGE凝膠電泳分離細(xì)胞裂解液中的可溶性蛋白，硝酸纖維膜轉(zhuǎn)印后，以兔抗小鼠NS3多克隆抗體測(cè)定

8、。 6、免疫接種。采用腹腔注射方式分別于兩種雌性動(dòng)物體內(nèi)免疫接種(初次/加強(qiáng))基因修飾樹突狀細(xì)胞(3×105)兩次，每次間隔10天。末次接種10日后，處死小鼠。取脾臟供細(xì)胞免疫分析用。收集血清測(cè)定抗原特異性抗體分析。 7、抗體分析。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法測(cè)定體液免疫應(yīng)答。重組NS3或病毒衣殼包被96孔板，除去非特異性結(jié)合后，與1/50稀釋的鼠血清共育1h。辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗鼠IgG，IgG1或IgG2a抗體(1/2000

9、)檢測(cè)NS3或腺病毒特異性抗體。 8、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法測(cè)定分泌IFN-γT細(xì)胞增殖反應(yīng)。系列稀釋的脾淋巴細(xì)胞懸液復(fù)孔置入包被抗IFN-γ抗體的96孔板.在100μlrNS3或ConA作用下，48小時(shí)后，加入生物素親和IFN-γ檢測(cè)抗體，及堿性磷酸酶偶聯(lián)streptavidin，以TNBT為底物，于解剖顯微鏡計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成數(shù)。 9、酶聯(lián)免疫法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞T輔助細(xì)胞因子分泌。分別以rNS3(0.1μg/ml)，ConA(1

10、μg/ml)或RPMI營(yíng)養(yǎng)液作為刺激劑活化每孔1×106的脾淋巴細(xì)胞，48小時(shí)后采用IFN-γ，IL-4，IL-2，IL-10檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子分泌水平。 結(jié)果： 1、重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞。AdNS3轉(zhuǎn)導(dǎo)293及DC均可檢測(cè)到約～70kDa處蛋白條帶。腺病毒轉(zhuǎn)染的基因可在DC細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)HCVNS3蛋白。且70％的DC感染MOI100的AdNS3顯示綠色熒光且無明顯細(xì)胞病理改變。骨髓細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)，7天后，90％細(xì)

11、胞表面抗原為CD11c陽性，即為樹突狀細(xì)胞。此類細(xì)胞感染并與活化因子LPS繼續(xù)共育2天后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD86andI-AdclassⅡ分子表達(dá)明顯增加。提示腺病毒可促進(jìn)DC成熟。蛋白沖擊DC仍可得同樣的結(jié)果。 2、重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)基因疫苗體內(nèi)免疫活性測(cè)定。兩種系小鼠兩次接種DC-AdNS3均產(chǎn)生明顯升高的抗NS3IgG抗體，并以IgG2a亞型為主。在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠組，DC-AdNS3免疫接種后，與D

12、C-AdGFP相比，NS3抗原(0.1μg/ml)誘導(dǎo)的IFN-γ分泌型T細(xì)胞反應(yīng)與也顯著增強(qiáng)(p＜0.01)。DC-rNS3加強(qiáng)接種后能產(chǎn)生明顯升高的T細(xì)胞應(yīng)答(p＜0.05)。相比之下，于Babl/c小鼠體內(nèi)采用相同途徑接種免疫疫苗后，僅DC-AdNS3組可觀察到明顯升高的T細(xì)胞反應(yīng)(p＜0.05)。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，Babl/c小鼠加強(qiáng)接種10天后，DC-AdNS3組T細(xì)胞懸液內(nèi)可測(cè)得高水平的IL-2，IFN-γ(p＜0.01

13、)以及顯著降低的IL-10分泌水平(p＜0.05)。DC-rNS3免疫動(dòng)物后，IL-2，IFN-γ分泌適度增加(p＜0.05)，IL-10微弱下降(p＞0.05)。在HLA-A2.1小鼠實(shí)驗(yàn)中也得出相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。即IL-2、IFN-γ明顯上升，IL-10顯著降低。 結(jié)論：腺病毒轉(zhuǎn)染DC可有效表達(dá)目的基因抗原，且與DC成熟因子LPS可共同刺激DC成熟而不影響其表型。DC-AdNS3以初次/加強(qiáng)方式免疫接種兩種系小鼠均能誘導(dǎo)明顯的

14、體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，即抗原特異性IgG抗體形成，其中IgG2a抗體亞型高于IgG1，同時(shí)刺激分泌IFN-γ的T細(xì)胞增殖應(yīng)答，促進(jìn)NS3特異性Th1細(xì)胞因子IL-2，IFN-γ的產(chǎn)生等。以腺病毒為載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的免疫作用強(qiáng)于蛋白沖擊樹突狀細(xì)胞。IgG2a與IgG1比例的升高，IFN-γ，IL-2Th1細(xì)胞因子明顯強(qiáng)于IL-4和IL-10等Th2細(xì)胞因子的分泌等相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步支持腺病毒轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞表達(dá)HCVNS3疫苗的Th1應(yīng)答