人BCG特異性T細胞的表型、功能特征及其調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、結(jié)核(TB)目前仍然是危害人類生命健康的重大傳染病之一。據(jù)報道，全世界每年大約有800萬新增結(jié)核病人，同時大約有200萬人死于結(jié)核。此外，由于多重耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)、HIV感染及卡介苗預(yù)防效果的不佳導(dǎo)致結(jié)核發(fā)病率逐年增加。雖然世界上有三分之一人口感染結(jié)核，但是TB的發(fā)病率只占感染者的5-10％，大約90％的人都處于隱性感染狀態(tài)，這說明機體能夠有效控制結(jié)核桿菌的生長繁殖。以往的研究表明，細胞免疫包括CD4、CD8和γδ T細胞等在結(jié)核防御

2、保護效應(yīng)中發(fā)揮著十分重要的作用。動物實驗表明，去除CD4+T細胞的小鼠易于感染結(jié)核，而被動轉(zhuǎn)輸感染過TB小鼠的CD4+T細胞后又能重獲保護性免疫力。在人體有類似的證明，HIV感染的結(jié)核病人，隨著CD4+T數(shù)量的下降，其病情的嚴重性加重，同時，肺外結(jié)核、分枝桿菌菌血癥的發(fā)生率進行性增多，這充分證實了CD4+T細胞在結(jié)核免疫中的重要性。 卡介苗(BCG)是目前臨床上唯一應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核的疫苗。流行病學調(diào)查的結(jié)果表明，BCG除了對兒童播

3、散型結(jié)核的發(fā)生有一定的預(yù)防作用外，對成人結(jié)核和兒童肺結(jié)核無明顯的預(yù)防作用。因此，BCG免疫或結(jié)核菌感染后是否能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生結(jié)核特異性效應(yīng)和長期記憶性T細胞，這群細胞是否能發(fā)揮有效保護作用，仍是十分重要的科學問題。目前研究的結(jié)果表明，當初始CD4+T細胞活化后，可以分化為Th1、Th2和Th17細胞等不同功能亞群，這些亞群在抵御TB感染中的作用亦不同。分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α等細胞因子的Th1細胞主要介導(dǎo)胞內(nèi)感染病原菌的免疫應(yīng)

4、答，而且，產(chǎn)生不同細胞因子譜的細胞亞群所發(fā)揮效應(yīng)功能及免疫記憶特性亦存在著差異。 當結(jié)核桿菌(MTB)進入機體后，機體將調(diào)動天然免疫(巨噬細胞、γδT細胞等)和獲得性免疫(Th1、CD8+T細胞等)多種機制殺傷清除MTB，抑制MTB擴散；與此同時，MTB也通過釋放某些抑制性蛋白或誘導(dǎo)機體細胞分泌抑制性因子或誘導(dǎo)抑制性細胞(調(diào)節(jié)性T細胞，Treg)的生成，間接或直接地抑制機體的免疫應(yīng)答，甚至使免疫細胞功能失活，達到逃避免疫攻擊，致

5、使MTB在機體內(nèi)存活和繁殖的目的。為此，一方面，人們期望尋找機體TB特異性免疫應(yīng)答，尤其是控制MTB相關(guān)的細胞亞群；另一方面，期望阻斷MTB逃逸免疫的過程以逆轉(zhuǎn)MTB誘導(dǎo)宿主的免疫抑制狀態(tài)，從而誘導(dǎo)抗TB免疫應(yīng)答反應(yīng)，防治TB。 本研究的目的在于： 1)探討B(tài)CG免疫或結(jié)核菌感染后是否能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生BCG特異性效應(yīng)/記憶T細胞； 2)結(jié)核特異性效應(yīng)/記憶T細胞的亞群(CD4、CD8、γδT細胞)、表型特征及功能；

6、 3)結(jié)核抗原特異性效應(yīng)/記憶細胞的調(diào)控因素及其機制； 4)結(jié)核病人病灶局部抗原特異性T細胞的表型和功能特點。 為了實現(xiàn)上述目標，該論文進行了較為系統(tǒng)的研究，結(jié)果分為以下四個部分： 第一部分：PPD+者或結(jié)核隱性感染者PBMCs中存在BCG特異性記憶性Th1細胞，這些細胞受到調(diào)節(jié)性T細胞的調(diào)控。 本實驗以PPD+者或隱性感染者以及活動性結(jié)核病人為研究對象，檢測其BCG特異性T細胞免疫應(yīng)答特征，探討

7、了Treg細胞對其免疫應(yīng)答的抑制作用及其機制。結(jié)果表明，PPD+正常人PBMCs經(jīng)BCG刺激后可誘導(dǎo)IFN—γ的產(chǎn)生，且主要是CD4+而非CD8+T細胞。IFN—γ+CD4+T細胞主要為記憶細胞，包括中央型和效應(yīng)型記憶細胞。為了進一步探討Treg細胞是否調(diào)控BCG特異性效應(yīng)/記憶Th1細胞的免疫應(yīng)答，本研究又檢測了結(jié)核病人外周血Treg細胞的數(shù)量、表型、功能特征及其調(diào)節(jié)機制。結(jié)果表明，CD4+CD25highFoxp3+和CD4+CD2

8、5highCTLA—4+細胞比例在結(jié)核病人顯著地高于正常人，該細胞的表型特征為CD45RA—CD45RO+CD62Lhigh，表達HLA—DR和GITR水平高于CD4+CD25-和CD4+CD25low細胞，而且能夠抑制BCG特異性效應(yīng)細胞分泌IFN—γ，而加入抗IL-10中和抗體后能逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，提示免疫調(diào)節(jié)因素在結(jié)核的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。 第二部分：BCG特異性多功能效應(yīng)/記憶性T細胞的表型、功能特征及其調(diào)節(jié)。

9、在第一部分試驗中，我們證明了PPD+者外周血中存在著BCG特異性記憶Th1細胞，這些細胞受控于Treg細胞。本實驗進一步檢測了BCG是否能誘導(dǎo)其它Th1細胞因子的產(chǎn)生。結(jié)果表明，除了IFN—γ之外，CD4+T細胞還分泌IL—2和TNF—α。依據(jù)分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α三種細胞因子的不同組合，BCG特異性Th1細胞至少可以分為七個亞群，其中單陽性細胞所占比例最高，且細胞因子的熒光強度在不同亞群也存在差異。以往多數(shù)研究在檢測結(jié)核

10、特異性T細胞功能時，均以細胞因子分泌作為評價指標，這并不能完全反映T細胞的功能。在本實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)，無論PPD+正常人或結(jié)核病人，BCG只能誘導(dǎo)CD4+而非CD8+T細胞產(chǎn)生細胞因子。然而，在相同培養(yǎng)條件下，CD4+和CD8+T細胞均會發(fā)生活化、分裂、增殖。表型分析表明，增殖的CD4+T細胞為CD25+CD45RA—CCR7-CD62L+，而CD8+T細胞為 CD25+CD45RA+/—CCR7+CD62Lhigh，表明這些CD4+

11、T或CD8+T細胞為效應(yīng)型或中央型記憶細胞。在多克隆刺激劑刺激后，這些BCG特異性增殖的CD4+和CD8+T細胞能夠分泌Th1細胞因子，并且，特異性增殖的CD8+T細胞表達顆粒酶B。此外，我們發(fā)現(xiàn)Treg細胞能夠抑制BCG特異性誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T細胞增殖及IFN—γ分泌，這種抑制作用可部分被IL-10中和抗體所逆轉(zhuǎn)。因此，本實驗通過對于活化、分裂、增殖等生物學功能的檢測，證明了PPD+正常人及結(jié)核病人PBMCs中存在功能性效應(yīng)型

12、/中央型記憶性CD4+和CD8+T細胞，并受到Treg的調(diào)控。 第三部分：結(jié)核菌抗原(ESAT—6)特異性記憶性γδ T細胞的表型、功能分析及其調(diào)節(jié)。 除了觀察對BCG的反應(yīng)性之外，本實驗檢測了PPD陽性正常人對于結(jié)核抗原ESAT—6的反應(yīng)性，ESAT—6能顯著增加IFN—γ產(chǎn)生的量和IFN—γ陽性細胞頻數(shù)。且IFN—γ主要是由γδ T細胞而非CD4、CD8和NK細胞所分泌。此外，抗原特異性γδT細胞還分泌TNF—α，但

13、不表達IL—2。該細胞表達CD45RO而不表達CD45RA，且臍帶血單個核細胞對ESAT—6無應(yīng)答，表明該抗原特異性γδ T細胞為記憶性T細胞。純化的γδ T細胞能夠?qū)AST—6發(fā)生應(yīng)答，即不依賴于抗原提呈的作用。為進一步驗證γδ T細胞應(yīng)答是否需要CD4+T細胞的輔助，純化出CD4+T細胞，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞不僅未能增加γδT細胞的IFN—γ產(chǎn)生，反而抑制了IFN—γ的產(chǎn)生，據(jù)此推論可能為Treg細胞的作用。因此，分別分離CD4+C

14、D25+、CD4+CD25-和γδ T細胞，結(jié)果表明，Treg細胞而非CD4+CD25-細胞能夠抑制γδ T細胞IFN—γ的產(chǎn)生，且能夠被抗IL-10的中和抗體逆轉(zhuǎn)，說明CD4+CD25+細胞部分通過可溶性細胞因子發(fā)揮對γδ T細胞的抑制作用。 第四部分：結(jié)核菌病灶部位(結(jié)核性胸膜炎病人胸水中)BCG特異性記憶性T細胞的表型和功能特征。 由于結(jié)核發(fā)病部位的局限性，病灶局部免疫應(yīng)答對于研究結(jié)核病的免疫狀態(tài)具有十分重要的意義

15、，因此，本部分內(nèi)容對于結(jié)核性胸膜炎病人胸水BCG特異性T細胞進行了分析。結(jié)果表明，BCG刺激后能夠誘導(dǎo)CD4+T細胞分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α，且比例顯著高于結(jié)核病人PBMCs。依據(jù)上述三種細胞因子的分泌與否可以將Th1細胞分為七個不同亞群，單陽性細胞亞群所占比例最高，其次為雙陽性細胞亞群，最后為三陽性細胞。進一步分析各細胞亞群細胞因子表達的熒光強度，結(jié)果表明，按細胞因子產(chǎn)生數(shù)量的多少，(3+)>(2+)>(1+)的細胞亞群，

16、各亞群中同種細胞因子表達的熒光強度呈下降趨勢，即在單個細胞水平上進行比較時，(3+)細胞亞群不僅產(chǎn)生細胞因子的種類多，且產(chǎn)生細胞因子的量也遠遠高于細胞因子單陽性和雙陽性細胞亞群。表型分析表明BCG特異性IFN—γ+細胞為效應(yīng)型或中央型記憶細胞。 本研究的結(jié)論和創(chuàng)新之處： 1、PPD+正常人及結(jié)核病人PBMCs中存在BCG特異性多功能記憶CD4+T細胞； 2、BCG特異性記憶CD8+T細胞可以發(fā)生活化、分裂、增殖；

17、 3、Treg細胞抑制BCG特異性記憶性CD4+和CD8+T細胞增殖及細胞因子分泌； 4、PPD+正常人PBMCs中存在結(jié)核菌特異性記憶性γδ T細胞，且受到Treg細胞的調(diào)控； 5、結(jié)核性胸膜炎病人胸水存在BCG特異性多功能性記憶性CD4+T細胞，但單陽性細胞亞群所占比例最高。 該研究將為深入了解疫苗免疫或結(jié)核菌感染后結(jié)核抗原特異性T細胞的表型和功能特征、結(jié)核應(yīng)答的調(diào)控因素、結(jié)核桿菌逃逸機體免疫監(jiān)視的機