肽鏈釋放因子與tRNA的協(xié)同進(jìn)化對(duì)終止密碼子重新分配的影響.pdf

1、當(dāng)終止密碼子UAA、UAG或者UGA到達(dá)核糖體A位點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生終止。在原核生物和真核生物中，該過(guò)程由兩類肽鏈釋放因子共同參與，但是二者的作用機(jī)制并不相同。原核生物第一類肽鏈釋放因子有2個(gè):RF1和RF2。RF1由線性三肽反密碼子Pro-Ala-Thr(PAT)識(shí)別UAA和UAG，而RF2利用Ser-Pro-Phe(SPF)三肽反密碼子識(shí)別UAA和UGA;第二類肽鏈釋放因子RF3在肽鏈釋放后通過(guò)GTP水解使第一類釋放因子循環(huán)利用。

2、而真核生物大多數(shù)只有一個(gè)第一類肽鏈釋放因子，eRF1，負(fù)責(zé)識(shí)別三個(gè)終止密碼子，但是它識(shí)別終止密碼子的機(jī)制并不清楚;第二類肽鏈釋放因子eRF3則促進(jìn)某些終止信號(hào)的識(shí)別，并通過(guò)eRF1的釋放來(lái)調(diào)節(jié)新生肽鏈的釋放速率。
　　 由于真核生物中兩類肽鏈釋放因子的協(xié)同作用在肽鏈合成終止和釋放過(guò)程發(fā)揮著重要的作用，而在原核生物中，第二類肽鏈釋放因子RF3只能協(xié)同GTP在翻譯終止后促使RF1/2從核糖體上解離，兩者之間沒(méi)有相互作用關(guān)系。學(xué)者認(rèn)為

3、滴蟲(chóng)線粒體形成之間產(chǎn)生，是原生動(dòng)物中最為原始的一個(gè)類群。其肽鏈釋放因子的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化程度較高的纖毛蟲(chóng)和高等真核生物相比具有明顯的差異。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將克隆得到的滴蟲(chóng)兩類肽鏈釋放因子的基因Tv eRF1和Tv eRF3分別連接到酵母表達(dá)載體pGADT7和pGBKT7中，然后共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109。利用酵母雙雜交技術(shù)我們證實(shí)滴蟲(chóng)的eRF1和eRF3存在相互作用關(guān)系，說(shuō)明滴蟲(chóng)的兩類肽鏈釋放因子通過(guò)相互作用，協(xié)同參與蛋白質(zhì)翻譯終止過(guò)程。這為進(jìn)

4、一步研究參與蛋白質(zhì)翻譯終止的肽鏈釋放因子的進(jìn)化和生物的進(jìn)化之間的關(guān)系提供了數(shù)據(jù)支持。
　　 在進(jìn)化過(guò)程中纖毛蟲(chóng)把部分公認(rèn)的終止密碼子重新分配成有義密碼子。草履蟲(chóng)、四膜蟲(chóng)、棘尾蟲(chóng)和尖毛蟲(chóng)只用UGA做為終止密碼子，而用UAA和UAG編碼谷氨酸;而游仆蟲(chóng)則將UGA翻譯為半胱氨酸，UAA和UAG識(shí)別為終止密碼子。有研究認(rèn)為纖毛蟲(chóng)密碼子的重分配可能由RF結(jié)構(gòu)和功能的變化、突變壓力和新的tRNA出現(xiàn)引起，其中eRF1結(jié)構(gòu)上的改變可能在終止密

5、碼子的重分配中起主要作用。
　　 首先本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了原生動(dòng)物賈第蟲(chóng)eRF1雜合基因G1/Sc eRF1，它由賈第蟲(chóng)eRF1的N端和釀酒酵母eRF1的M端、C端結(jié)構(gòu)域組成。把該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入敲除內(nèi)源eRF1的酵母菌株YDB447中分析其識(shí)別終止密碼子的活性和性質(zhì)。質(zhì)粒洗牌技術(shù)的研究結(jié)果表明，G1/Sc eRF1作為唯一的eRF1能支持細(xì)胞生長(zhǎng)，而雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析卻發(fā)現(xiàn)G1/Sc eRF1不識(shí)別三個(gè)終止密碼子。對(duì)eRF1N端的關(guān)鍵

6、氨基酸突變后發(fā)現(xiàn)GTS環(huán)結(jié)構(gòu)可能負(fù)責(zé)識(shí)別UAG中的第三位堿基G3，而“YCF”模體對(duì)UGA的識(shí)別最為有效。
　　 其次我們?cè)谙惹皹?gòu)建好的Eo/Sc eRF1b的基礎(chǔ)上，對(duì)eRF1識(shí)別終止密碼子3個(gè)堿基的三個(gè)“口袋（cavity）”結(jié)構(gòu)周?chē)年P(guān)鍵氨基酸進(jìn)行組合突變發(fā)現(xiàn)，口袋1周?chē)年P(guān)鍵氨基酸的突變使得Eo eRF1b識(shí)別UAA和UAG的第二位堿基A2;M51、E55、Y125的突變與UGA的識(shí)別最相關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)還從八肋游仆蟲(chóng)中