賈第蟲GeRF1識(shí)別終止密碼子性質(zhì)分析.pdf

1、蛋白質(zhì)合成是細(xì)胞內(nèi)最重要的生命活動(dòng)之一，其中包括RNA-RNA，RNA-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用。這一過程包括核糖體上肽鏈合成的起始、延伸和新生肽鏈的釋放。肽鏈的起始和延伸主要有起始因子和延伸因子的參與，而兩類肽鏈釋放因子(polypeptide release factor，RF)負(fù)責(zé)終止密碼子的識(shí)別和新生肽鏈的釋放。
　　在真核生物中第一類肽鏈釋放因子(eRF1)一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列有顯著的同源性，由N、M、C三個(gè)不同功能結(jié)構(gòu)域

2、組成。結(jié)構(gòu)域N在核糖體A位點(diǎn)識(shí)別三個(gè)終止密碼子，它含有兩個(gè)高度保守的序列TASNIKS和Y(×)C(×××)F。結(jié)構(gòu)域M通常含有GGQ模體，與核糖體上的肽酰轉(zhuǎn)移酶中心相互作用引起肽酰-tRNA的水解。eRF1的C結(jié)構(gòu)域與eRF3相互作用。eRF3是一種G蛋白，其C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與eRF1結(jié)合，在核糖體外形成穩(wěn)定的復(fù)合體，參與新生肽鏈從核糖體上的釋放，共同完成蛋白質(zhì)多肽鏈的合成過程。
　　高等真核生物第一類肽鏈釋放因子識(shí)別三個(gè)通用的終

3、止密碼子，完成新生肽鏈的釋放。在原生動(dòng)物纖毛蟲中終止密碼子發(fā)生重新分配的現(xiàn)象，如Paramecium、Tetrahymena和Stylonychia將通用終止密碼子UAA和UAG翻譯成谷氨酸酰胺，將UGA識(shí)別為終止密碼。Euplotes中UAA和UAG作為終止密碼子，而通用終止密碼子UGA翻譯成半胱氨酸。這種現(xiàn)象提示我們，肽鏈釋放因子識(shí)別終止密碼子的活性和性質(zhì)可能具有一定的進(jìn)化學(xué)特征。
　　藍(lán)氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamb

4、lia）為鞭毛類單細(xì)胞真核生物，是原生動(dòng)物中最為原始的一個(gè)類群。細(xì)胞內(nèi)沒有典型的線粒體結(jié)構(gòu)，認(rèn)為是在線粒體形成之前產(chǎn)生的物種。其肽鏈釋放因子的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化程度較高的纖毛蟲和高等真核生物相比具有明顯的差異，為我們研究蛋白質(zhì)合成終止機(jī)制的進(jìn)化提供了理想了模式。
　　本研究以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲為材料，從基因組擴(kuò)增得到了其兩類肽鏈釋放因子基因GeRF1和GeRF3。將它們分別連接到酵母表達(dá)載體pGADT7和pGBKT7中，共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH10

5、9，涂板培養(yǎng)。利用酵母雙雜交技術(shù)證實(shí)賈第蟲eRF1和eRF3在體內(nèi)相互作用，說明在賈第蟲中兩類肽鏈釋放因子通過協(xié)同作用參與蛋白質(zhì)合成的終止過程。
　　以往的研究表明，第一類肽鏈釋放因子的N端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)終止密碼子的識(shí)別，故我們構(gòu)建了由賈第蟲eRF1的N端結(jié)構(gòu)域與釀酒酵母的M和C端結(jié)構(gòu)域組成的重組基因Gl/Sc eRF1。在第一類肽鏈釋放因子被敲除的酵母菌株YDB447中分析賈第蟲第一類肽鏈釋放因子識(shí)別終止密碼子的性質(zhì)和活性。首先，將

6、構(gòu)建的Gl/Sc eRF1基因克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒pDB984中，利用5'-FOA驅(qū)除含有酵母野生型eRF1基因的質(zhì)粒，觀察在重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白Gl/Sc eRF1作為細(xì)胞中唯一肽鏈釋放因子的情況下酵母細(xì)胞的活力，分析融合蛋白Gl/Sc eRF1識(shí)別終止密碼子的活性和性質(zhì)。結(jié)果顯示，含有該融合蛋白的酵母細(xì)胞不能正常的生長，說明Gl/Sc eRF1在酵母細(xì)胞中不能識(shí)別終止密碼子。
　　進(jìn)一步用雙熒光素酶通讀報(bào)告系統(tǒng)分析融合蛋白Gl

7、/Sc eRF1分別對(duì)三個(gè)終止密碼子的識(shí)別活性。證實(shí)融合的Gl/Sc eRF1不能識(shí)別三個(gè)終止密碼子。對(duì)GeRF1的N端結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵的氨基酸進(jìn)行突變(T26L，G48K，N112E T113N，S134N)，使其與酵母相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸一致。結(jié)果表明盡管突變體Gl/Sc eRF1識(shí)別三個(gè)終止密碼子的活性發(fā)生了一些變化，但是與野生型相比，其識(shí)別活性不足以維持細(xì)胞的正常生存。
　　盡管其他高等真核生物的第一類肽鏈釋放因子的N端負(fù)責(zé)識(shí)別三