依普黃酮對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨生物學(xué)、生物力學(xué)性能作用的體外研究.pdf

1、目的：
　　1、研究Indian hedgehog(Ihh)信號通路抑制劑—依普黃酮（ipriflavone,IP）是否可以阻止骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）軟骨細(xì)胞的肥大分化及軟骨組織的降解，從而緩解OA；
　　2、研究IP對 OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響，從而為治療OA提供實驗依據(jù)；
　　3、運用微管吸吮技術(shù)，研究Ihh(力學(xué)敏感基因)通路抑制劑—IP是否可改善OA軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)性能。

2、　　方法：
　　1、選取因OA進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換而截下的outbridge評分1-2分的脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨，消化成軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、切成4mm3大小進(jìn)行軟骨組織塊培養(yǎng)；
　　2、采用熒光免疫的方法鑒定軟骨細(xì)胞表型，以確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞；
　　3、軟骨細(xì)胞、軟骨組織塊實驗均分為DMSO空白組、IP低濃度組、IP高濃度組；
　　4、于IP干預(yù)2天培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR，檢測SMO、Gli-1、Gli-2、

3、Gli-3（Ihh信號通路指標(biāo)）、Runx-2、MMP-13（軟骨細(xì)胞肥大指標(biāo)）及COL II、Aggrecan（軟骨代謝指標(biāo)）；細(xì)胞進(jìn)行Western Blotting，檢測COLII、MMP-13、COLX蛋白的變化；
　　5、于IP干預(yù)2天培養(yǎng)后采用CCK-8、EdU及流式方法檢測IP對OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響情況；
　　6、于IP干預(yù)2天培養(yǎng)后，細(xì)胞進(jìn)行微管吸吮，觀察IP對OA軟骨細(xì)胞生物力學(xué)性能的影響。

4、　　7、IP干預(yù)OA軟骨組織塊2天后石蠟切片番紅O-固綠染色，高倍鏡下觀察蛋白多糖的變化，并進(jìn)行組織學(xué)Mankin評分；進(jìn)行免疫熒光染色，檢測COL II、Runx-2、COL X蛋白表達(dá)的變化；
　　結(jié)果：
　　1、軟骨細(xì)胞表型鑒定：細(xì)胞免疫熒光染色顯示，所培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞 I型膠原（COL I）染色為陰性，II型膠原（COL II）的染色為陽性，可以確定從軟骨組織中分離的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞；
　　2、IP通過抑制 Ihh

5、信號通路對 OA軟骨細(xì)胞的肥大分化及細(xì)胞代謝影響的RT-qPCR結(jié)果：IP藥物組Ihh信號通路指標(biāo)SMO、Gli-1、Gli-2、Gli-3及軟骨細(xì)胞肥大分化指標(biāo) Runx-2、MMP-13的 mRNA較 DMSO空白組表達(dá)水平下降（P<0.05），軟骨細(xì)胞代謝指標(biāo) Aggrecan（蛋白多糖）、COL II的 mRNA水平較DMSO對照組顯著增高（P<0.05）；
　　3、IP可以促進(jìn)OA軟骨Col II蛋白表達(dá)，抑制MMP-1

6、3、COLX蛋白表達(dá)：IP干預(yù)OA軟骨細(xì)胞2天后，Western Blotting結(jié)果表明，IP藥物組OA軟骨細(xì)胞的Col II蛋白表達(dá)明顯多于DMSO對照組，MMP-13、COLX（軟骨細(xì)胞肥大分化的OA指標(biāo)）表達(dá)較DMSO對照組更少，灰度值半定量結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；
　　4、IP對OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響:首先用CCK-8檢測增殖情況，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)第3天、第4天時，IP藥物組的細(xì)胞增殖明顯高于DMSO

7、對照組（P<0.05）；針對細(xì)胞第3天的增殖結(jié)果，采用EdU染色驗證了CCK-8檢測增殖的結(jié)果；流式方法測 IP對 OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)第3天，IP藥物組的軟骨細(xì)胞凋亡率相對DMSO對照組均顯著降低（P<0.05）；
　　5、微管吸吮分析IP對OA軟骨細(xì)胞生物力學(xué)特性的影響：人OA軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為典型的黏彈性固體蠕變特征，細(xì)胞瞬時模量（E0）、平衡模量（E∞）、表觀黏性（μ）較正常軟骨細(xì)胞均升高，但用IP藥物干預(yù)

8、后，OA軟骨細(xì)胞的E0、E∞、μ明顯降低，生物力學(xué)性能得到改善(P＜0.05)；
　　6、IP體外干預(yù)人OA軟骨組織塊2天后番紅O-固綠染色顯示IP對OA軟骨組織塊蛋白多糖的影響：IP藥物干預(yù)人OA軟骨組織塊后，IP藥物組軟骨組織塊相對DMSO對照組其軟骨細(xì)胞更多、蛋白多糖（PG）染色更深；組織學(xué) Mankin評分DMSO對照組、IP低濃度組、IP高濃度組3組分別為8.34±0.58，4.67±0.57(P<0.01)，2.34±

9、0.28(P<0.001)，分?jǐn)?shù)越低，OA軟骨退變越輕；
　　7、免疫熒光染色顯示IP對OA軟骨組織塊相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：IP體外干預(yù)人OA軟骨組織塊2天后的免疫熒光染色顯示，IP藥物組軟骨組織塊的Col II明顯多于DMSO對照組，Runx-2、COL X表達(dá)較DMSO對照組更少。可見，IP可以促進(jìn)OA軟骨組織塊Col II表達(dá)，抑制Runx-2、COL X表達(dá)，從而緩解軟骨組織塊的降解。
　　結(jié)論：
　　Ihh通路