miRNA-502-5p對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的生物學(xué)作用及機(jī)制研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種嚴(yán)重危害中老年人身心健康的退行性關(guān)節(jié)疾病，主要病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的磨損及退變，臨床上常出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛反復(fù)發(fā)作、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙而且不斷加重等癥狀。關(guān)節(jié)軟骨主要包括軟骨細(xì)胞(chondrocyte)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)兩種組分。目前，OA的發(fā)病機(jī)理仍不清楚，針對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷進(jìn)行研究對(duì)于闡明OA的發(fā)病機(jī)制有重要意義，為OA的預(yù)防及干預(yù)治療提供理論依據(jù)

2、。
　　MicroRNAs(MiRNAs)是一種普遍存在于真核生物中的單鏈RNA分子，一般長度約為17～25 nt。 MiRNA可能存在于基因組的各個(gè)區(qū)域，例如基因的間隔區(qū)、編碼基因的內(nèi)含子區(qū)。MiRNA參與調(diào)控許多生命活動(dòng)，例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和器官發(fā)育等。目前研究表明，miRNA在OA的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程中有非常重要的意義。
　　目的:
　　本研究旨在探討miR-502-5p在正常和OA軟骨組織中的表達(dá)水平

3、差異，進(jìn)而研究miR-502-5p對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制，為OA疾病探尋新的治療靶點(diǎn)并提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　miR-502-5p在OA軟骨組織中的表達(dá)及其生物學(xué)作用的研究。首先，用RT-PCR方法檢測了四個(gè)預(yù)測的miRNAs(miR-502-5p、miR-138、miR-205、miR-146a)在20組正常和OA軟骨組織中的表達(dá)水平差異。用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法分離培養(yǎng)

4、正常的軟骨細(xì)胞，然后作不同處理，分為四組:對(duì)照組，正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞;IL-1β組，用IL-1β處理的軟骨細(xì)胞;miR-502-5pmimic組，轉(zhuǎn)染miR-502-5pmimic后再用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞;陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-502-5p negative control后再用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。RT-PCR方法檢測不同處理組miR-502-5p的表達(dá)水平差異。MTT方法檢測不同處理組的細(xì)胞增殖水平。流式細(xì)胞儀檢測不同處理組

5、的細(xì)胞凋亡水平。Westernblot方法檢測不同處理組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。RT-PCR和western blot方法檢測不同處理組促炎因子IL-6、TNFα和IL-8的表達(dá)水平。RT-PCR和western blot方法檢測不同處理組ECM結(jié)構(gòu)蛋白蛋白聚糖和Ⅱ型膠原、金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)水平。關(guān)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路與miR-502-5p-p5

6、3調(diào)控回路關(guān)系的研究。RT-PCR和western blot方法檢測了p53在20組正常和OA軟骨組織中的表達(dá)水平差異。分離培養(yǎng)正常的軟骨細(xì)胞，首先探究p53對(duì)miR-502-5p的調(diào)控作用，對(duì)軟骨細(xì)胞作不同處理后分為四組:對(duì)照組，正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞;IL-1β組，用IL-1β處理軟骨細(xì)胞;si-p53+IL-1β組，轉(zhuǎn)染p53 siRNA，再用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞;陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染p53 negative control，再用IL-

7、1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。關(guān)于miR-502-5p的靶標(biāo)基因及相關(guān)通路的研究。RT-PCR和western blot方法檢測了TRAF2在20組正常和OA軟骨組織中的表達(dá)水平差異。胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法分離培養(yǎng)正常的軟骨細(xì)胞。構(gòu)建TRAF23'-UTR的熒光素酶報(bào)告載體，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)研究miR-502-5p對(duì)TRAF2的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　miR-502-5p在OA軟骨組織中的表達(dá)下調(diào)，且發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。與

8、正常對(duì)照組相比，OA軟骨組織中miR-502-5p的表達(dá)顯著下調(diào)。IL-1β處理軟骨細(xì)胞使miR-502-5p的表達(dá)顯著下調(diào)。miR-502-5p mimic的轉(zhuǎn)染使miR-502-5p表達(dá)明顯提升。與對(duì)照組相比，IL-1β組的細(xì)胞增殖率下降;細(xì)胞凋亡率顯著增加;抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)顯著上調(diào);IL-6、IL-8和TFα的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上升;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的mRNA和蛋

9、白表達(dá)顯著下調(diào)，而MMP-3、MMP-9和MMP-13等金屬蛋白酶的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。與IL-1β組相比，miR-502-5p mimic組的細(xì)胞增殖率有顯著上調(diào);凋亡率顯著降低;抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)，而凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào);IL-6、IL-8和TNFα的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的mRNA和蛋白表達(dá)都有顯著升高，而MMP-3、MMP-9和MMP-13的mRNA和

10、蛋白表達(dá)顯著下降。表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過調(diào)控p53，進(jìn)而調(diào)控miR-502-5p的表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，OA軟骨組織中p53的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而且p53與miRNA-502-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。與對(duì)照組相比，IL-1β組p53的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào);miR-502-5p的表達(dá)水平顯著下降;miR-502-5p啟動(dòng)子活性顯著降低。與IL-1β組相比，si-p53組p53的蛋白表達(dá)顯著降低;miR-

11、502-5p的表達(dá)水平顯著升高;miR-502-5p的啟動(dòng)子活性顯著上升。與對(duì)照組相比，IL-1β組p53的mRNA和蛋白水平顯著升高;pGL3-p533'-UTR的熒光素酶活性無顯著變化;與IL-1β組相比，miR-502-5p mimic組p53的蛋白水平顯著降低，而mRNA水平無顯著差異;pGL3-p533'-UTR的熒光素酶活性無顯著變化。與正常對(duì)照組相比，OA軟骨組織中Wnt蛋白Wnt1和Wnt3a的表達(dá)顯著上調(diào)，β-cate

12、nin的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，IL-1β組 Wnt3a、β-catenin和p53的表達(dá)水平上調(diào);miR-502-5p的表達(dá)水平顯著下降。與IL-1β組相比，Wnt3a抑制劑組Wnt3a、β-catenin和p53的表達(dá)水平均顯著下調(diào);miR-502-5p的表達(dá)水平顯著升高。miR-502-5p的靶基因TRAF2及TRAF2介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路研究。與正常對(duì)照組相比，OA軟骨組織中TRAF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上

13、調(diào)，而且TRAF2與miRNA-502-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過軟件預(yù)測出miR-502-5p與TRAF23'-UTR存在靶標(biāo)關(guān)系。與miR-502-5p陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，miR-502-5p mimic轉(zhuǎn)染組的pGL3-TRAF23'-UTR載體熒光素酶活性顯著降低，同時(shí)pGL3-TRAF23'-UTR mut載體的熒光素酶活性無顯著變化。與對(duì)照組相比，IL-1β組TRAF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著升高;與IL-1β組相比

14、，miR-502-5p mimic組TRAF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。與對(duì)照組相比，IL-1β組誘導(dǎo)NF-κB通路的激活，使NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而IκB-α蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào);細(xì)胞增殖率下降;細(xì)胞凋亡率顯著增加;IL-6、IL-8和TNFα的蛋白表達(dá)水平顯著增加;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的蛋白表達(dá)水平顯著減少，而MMP-3、MMP-9和MMP-13等金屬蛋白酶的表達(dá)顯著上升。與IL-1β組相比，PDTC組、miR-50

15、2-5p mimic組和si-TRAF2組抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，使NF-κB表達(dá)水平顯著下降，而IκB-α表達(dá)顯著升高;細(xì)胞增殖率顯著升高;細(xì)胞凋亡率顯著下降;IL-6、IL-8和TNFα的蛋白表達(dá)水平顯著降低;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的蛋白水平顯著升高，而MMP-3、MMP-9和M M P-13等蛋白酶的表達(dá)顯著降低。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-502-5p在OA軟骨組織和IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中

16、表達(dá)顯著下調(diào)，對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，包括促進(jìn)軟骨增殖，減少細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子的生成以及促進(jìn)ECM代謝平衡。p53可以調(diào)控miR-502-5p的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響其表達(dá)，而miR-502-5p能夠反向抑制p53的表達(dá)，表明miR-502-5p與p53形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)控回路。Wnt/β-catenin通過正向調(diào)控p53的表達(dá)影響miR-502-5p-p53負(fù)反饋調(diào)節(jié)回路。進(jìn)一步機(jī)制分析表明，miR-502-5p靶向調(diào)節(jié)TR