miRNA-502-5p對骨關節(jié)炎軟骨細胞損傷的生物學作用及機制研究.pdf

1、骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種嚴重危害中老年人身心健康的退行性關節(jié)疾病，主要病理變化為關節(jié)軟骨的磨損及退變，臨床上常出現(xiàn)關節(jié)疼痛反復發(fā)作、關節(jié)活動障礙而且不斷加重等癥狀。關節(jié)軟骨主要包括軟骨細胞(chondrocyte)和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)兩種組分。目前，OA的發(fā)病機理仍不清楚，針對軟骨細胞的損傷進行研究對于闡明OA的發(fā)病機制有重要意義，為OA的預防及干預治療提供理論依據(jù)

2、。
　　MicroRNAs(MiRNAs)是一種普遍存在于真核生物中的單鏈RNA分子，一般長度約為17～25 nt。 MiRNA可能存在于基因組的各個區(qū)域，例如基因的間隔區(qū)、編碼基因的內含子區(qū)。MiRNA參與調控許多生命活動，例如細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡和器官發(fā)育等。目前研究表明，miRNA在OA的發(fā)生與發(fā)展進程中有非常重要的意義。
　　目的:
　　本研究旨在探討miR-502-5p在正常和OA軟骨組織中的表達水平

3、差異，進而研究miR-502-5p對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的生物學作用及其作用機制，為OA疾病探尋新的治療靶點并提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　miR-502-5p在OA軟骨組織中的表達及其生物學作用的研究。首先，用RT-PCR方法檢測了四個預測的miRNAs(miR-502-5p、miR-138、miR-205、miR-146a)在20組正常和OA軟骨組織中的表達水平差異。用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法分離培養(yǎng)

4、正常的軟骨細胞，然后作不同處理，分為四組:對照組，正常培養(yǎng)的軟骨細胞;IL-1β組，用IL-1β處理的軟骨細胞;miR-502-5pmimic組，轉染miR-502-5pmimic后再用IL-1β誘導軟骨細胞;陰性對照組，轉染miR-502-5p negative control后再用IL-1β誘導軟骨細胞。RT-PCR方法檢測不同處理組miR-502-5p的表達水平差異。MTT方法檢測不同處理組的細胞增殖水平。流式細胞儀檢測不同處理組

5、的細胞凋亡水平。Westernblot方法檢測不同處理組凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表達水平。RT-PCR和western blot方法檢測不同處理組促炎因子IL-6、TNFα和IL-8的表達水平。RT-PCR和western blot方法檢測不同處理組ECM結構蛋白蛋白聚糖和Ⅱ型膠原、金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達水平。關于Wnt/β-catenin信號通路與miR-502-5p-p5

6、3調控回路關系的研究。RT-PCR和western blot方法檢測了p53在20組正常和OA軟骨組織中的表達水平差異。分離培養(yǎng)正常的軟骨細胞，首先探究p53對miR-502-5p的調控作用，對軟骨細胞作不同處理后分為四組:對照組，正常培養(yǎng)的軟骨細胞;IL-1β組，用IL-1β處理軟骨細胞;si-p53+IL-1β組，轉染p53 siRNA，再用IL-1β誘導軟骨細胞;陰性對照組，轉染p53 negative control，再用IL-

7、1β誘導軟骨細胞。關于miR-502-5p的靶標基因及相關通路的研究。RT-PCR和western blot方法檢測了TRAF2在20組正常和OA軟骨組織中的表達水平差異。胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法分離培養(yǎng)正常的軟骨細胞。構建TRAF23'-UTR的熒光素酶報告載體，熒光素酶報告實驗研究miR-502-5p對TRAF2的調控作用。
　　結果:
　　miR-502-5p在OA軟骨組織中的表達下調，且發(fā)揮重要的生物學作用。與

8、正常對照組相比，OA軟骨組織中miR-502-5p的表達顯著下調。IL-1β處理軟骨細胞使miR-502-5p的表達顯著下調。miR-502-5p mimic的轉染使miR-502-5p表達明顯提升。與對照組相比，IL-1β組的細胞增殖率下降;細胞凋亡率顯著增加;抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調，凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達顯著上調;IL-6、IL-8和TFα的mRNA和蛋白表達水平顯著上升;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的mRNA和蛋

9、白表達顯著下調，而MMP-3、MMP-9和MMP-13等金屬蛋白酶的mRNA和蛋白表達顯著上調。與IL-1β組相比，miR-502-5p mimic組的細胞增殖率有顯著上調;凋亡率顯著降低;抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著上調，而凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達顯著下調;IL-6、IL-8和TNFα的mRNA和蛋白表達水平顯著下降;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的mRNA和蛋白表達都有顯著升高，而MMP-3、MMP-9和MMP-13的mRNA和

10、蛋白表達顯著下降。表明Wnt/β-catenin信號通路通過調控p53，進而調控miR-502-5p的表達。與正常對照組相比，OA軟骨組織中p53的mRNA和蛋白表達水平顯著上調，而且p53與miRNA-502-5p的表達呈負相關關系。與對照組相比，IL-1β組p53的蛋白表達水平顯著上調;miR-502-5p的表達水平顯著下降;miR-502-5p啟動子活性顯著降低。與IL-1β組相比，si-p53組p53的蛋白表達顯著降低;miR-

11、502-5p的表達水平顯著升高;miR-502-5p的啟動子活性顯著上升。與對照組相比，IL-1β組p53的mRNA和蛋白水平顯著升高;pGL3-p533'-UTR的熒光素酶活性無顯著變化;與IL-1β組相比，miR-502-5p mimic組p53的蛋白水平顯著降低，而mRNA水平無顯著差異;pGL3-p533'-UTR的熒光素酶活性無顯著變化。與正常對照組相比，OA軟骨組織中Wnt蛋白Wnt1和Wnt3a的表達顯著上調，β-cate

12、nin的表達水平也顯著上調。與對照組相比，IL-1β組 Wnt3a、β-catenin和p53的表達水平上調;miR-502-5p的表達水平顯著下降。與IL-1β組相比，Wnt3a抑制劑組Wnt3a、β-catenin和p53的表達水平均顯著下調;miR-502-5p的表達水平顯著升高。miR-502-5p的靶基因TRAF2及TRAF2介導的NF-κB信號通路研究。與正常對照組相比，OA軟骨組織中TRAF2的mRNA和蛋白表達水平顯著上

13、調，而且TRAF2與miRNA-502-5p的表達呈負相關關系。通過軟件預測出miR-502-5p與TRAF23'-UTR存在靶標關系。與miR-502-5p陰性對照轉染組相比，miR-502-5p mimic轉染組的pGL3-TRAF23'-UTR載體熒光素酶活性顯著降低，同時pGL3-TRAF23'-UTR mut載體的熒光素酶活性無顯著變化。與對照組相比，IL-1β組TRAF2的mRNA和蛋白表達水平都顯著升高;與IL-1β組相比

14、，miR-502-5p mimic組TRAF2的mRNA和蛋白表達水平顯著下調。與對照組相比，IL-1β組誘導NF-κB通路的激活，使NF-κB蛋白表達水平顯著上調，而IκB-α蛋白表達水平顯著下調;細胞增殖率下降;細胞凋亡率顯著增加;IL-6、IL-8和TNFα的蛋白表達水平顯著增加;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的蛋白表達水平顯著減少，而MMP-3、MMP-9和MMP-13等金屬蛋白酶的表達顯著上升。與IL-1β組相比，PDTC組、miR-50

15、2-5p mimic組和si-TRAF2組抑制NF-κB信號通路的激活，使NF-κB表達水平顯著下降，而IκB-α表達顯著升高;細胞增殖率顯著升高;細胞凋亡率顯著下降;IL-6、IL-8和TNFα的蛋白表達水平顯著降低;Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的蛋白水平顯著升高，而MMP-3、MMP-9和M M P-13等蛋白酶的表達顯著降低。
　　結論:
　　綜上所述，本研究結果表明miR-502-5p在OA軟骨組織和IL-1β誘導的軟骨細胞中

16、表達顯著下調，對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷有保護作用，包括促進軟骨增殖，減少細胞凋亡，降低炎癥因子的生成以及促進ECM代謝平衡。p53可以調控miR-502-5p的轉錄進而影響其表達，而miR-502-5p能夠反向抑制p53的表達，表明miR-502-5p與p53形成一個負反饋調控回路。Wnt/β-catenin通過正向調控p53的表達影響miR-502-5p-p53負反饋調節(jié)回路。進一步機制分析表明，miR-502-5p靶向調節(jié)TR