油菜籽油脂合成途徑上游ACCase和PEPCase基因的克隆及功能研究.pdf

1、植物油是日常生活中的必需品，是能量聚集的自然平臺，與消費者的生活息息相關(guān)。種子是植物油的主要貯藏器官，改良植物種子脂肪酸組成和提高含油量是油料作物研究的熱點之一。在脂肪酸生物合成途徑中，乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase，ACCase)是其中的關(guān)鍵酶之一，其主要作用是催化乙酰輔酶A羧化形成丙二酰輔酶A，為脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物的合成提供底物。另外，脂肪酸和蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，兩個代謝過程均需要利用糖酵解產(chǎn)物磷

2、酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)這一相同底物。PEP在丙酮酸激酶作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸生成乙酰輔酶A后在ACCase作用下進(jìn)入脂肪酸合成途徑，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)催化PEP合成草酰乙酸最終進(jìn)入蛋白質(zhì)代謝。PEPC是植物中具有多種生理功能的細(xì)胞質(zhì)酶，大量研究表明PEPC參與脂肪酸調(diào)控、碳/氮吸收并與鹽和干旱脅迫反應(yīng)有關(guān)，但對

3、其功能認(rèn)識仍很有限，尤其是細(xì)菌型PEPC。本研究分別利用正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)方法研究了脂肪酸代謝過程中相關(guān)酶ACCase和PEPC基因的調(diào)控機制。
　　 由于accD基因編碼的β-CT亞基是ACCase基因表達(dá)的限制因子，本研究通過在油菜籽粒中超量表達(dá)大腸桿菌異質(zhì)型ACCase基因，加速乙酰CoA羧化形成丙二酸單酰CoA這一關(guān)鍵進(jìn)程，提高油菜籽脂肪酸的起始合成能力。本研究克隆了甘藍(lán)型油菜及近緣種中異質(zhì)型ACCase的β-CT亞

4、基accD編碼基因，采用生物信息學(xué)的方法分析了氨基酸序列，構(gòu)建了受種子特異表達(dá)啟動子驅(qū)動的異質(zhì)型大腸桿菌ACCaseβ-CT亞基accD基因的植物表達(dá)載體以及大腸桿菌ACCase四個亞基基因分別受種子特異性表達(dá)啟動子驅(qū)動的植物串聯(lián)表達(dá)載體，將這兩個載體分別用于轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜“超油2號”。通過轉(zhuǎn)基因油菜的半定量PCR、蛋白質(zhì)、脂肪酸含量變化，研究了異質(zhì)型大腸桿菌基因accD與其它三個細(xì)胞核基因的互作對油菜脂肪酸合成的影響，為定向遺傳改良油

5、菜種子含油量建立了有效的技術(shù)體系。本研究還利用人工小RNA(artifical mRNA，amiRNA)技術(shù)敲除擬南芥細(xì)菌型Atppc4基因進(jìn)行功能分析，研究該基因在脂肪酸代謝以及耐鹽脅迫等方面的作用，以探討擬南芥中細(xì)菌型Atppc4基因敲除對植物型PEPC的影響，為今后改良油菜品質(zhì)提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　 1.以甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、甘藍(lán)（Brassica oleracea）、芥菜型油菜（Bra

6、ssica juncea）和白菜型油菜（Brassica rapa）幼嫩葉片的cDNA為模板，對異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶β-CT亞基（羧基轉(zhuǎn)移酶）的accD編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到長度分別為1470、1470、1464和1464bp的編碼序列，分別可編碼489、489、487和487個氨基酸的蛋白質(zhì)。白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍(lán)的accD序列登錄號分別為EU410075、EU410076和EU410077。結(jié)果表明來自4個油菜近緣種的acc

7、D基因高度同源，編碼的蛋白質(zhì)都具有相似的鋅指結(jié)構(gòu)和C-末端5個相同的基元，其中基元Ⅰ(GSMGSVVG)和基元Ⅱ(PLIIVCASGGARMQE)在所有植物及大腸桿菌（Escherichia coli)的β-CT亞基中普遍存在。Southern雜交顯示該基因在甘藍(lán)型油菜及其近緣種的基因組中呈單拷貝。
　　 2.本研究E.coli ACCase的β-CT亞基accD（eaccD）基因與擬南芥Rubisco小亞基(rbcS)轉(zhuǎn)運肽基

8、因融合，構(gòu)建以油菜Napin啟動子驅(qū)動的種子特異表達(dá)載體。利用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)法，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入“超油2號”，獲得了7個陽性轉(zhuǎn)基因株系。RT-PCR檢測其中3株的結(jié)果證明eaccD基因可在轉(zhuǎn)基因株系的種子中轉(zhuǎn)錄，但在葉片中不轉(zhuǎn)錄，說明該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入油菜中能引起植株種子eaccD基因的特異表達(dá)。通過轉(zhuǎn)基因與對照植株種子的油脂和蛋白質(zhì)含量的比較分析，發(fā)現(xiàn)對照種子的平均含油量為48.01％

9、、蛋白質(zhì)平均含量為25.10％;而7個轉(zhuǎn)基因株系油菜種子的平均含油量為52.08％，比對照含油量相對增加8.45％;但轉(zhuǎn)基因株系的蛋白質(zhì)含量則有不同程度的降低，平均比對照植株下降約6.69％。轉(zhuǎn)基因油菜千粒重比對照植株有所提高。因此大腸桿菌accD基因在油菜中的表達(dá)能夠增加種子重量和含油量。
　　 3.采用同尾酶反復(fù)酶切的方法，構(gòu)建了擬南芥Rubisco小亞基轉(zhuǎn)運肽與ACCase各亞基基因的融合串聯(lián)表達(dá)載體，用A.tumefac

10、iens介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化對照品種“超油2號”。經(jīng)過篩選獲得了11株轉(zhuǎn)化再生植株。經(jīng)PCR、Southern和GUS染色檢測證明4個目的基因已整合到T0再生植株油菜基因組中。T2轉(zhuǎn)基因株系平均含油量為49.59％，轉(zhuǎn)基因株系的合油量比對照(48.01％)提高了3.30％。
　　 4.構(gòu)建了人工小RNA表達(dá)載體Atppc4-amiRNA，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)花絮浸染法(in floral dip)轉(zhuǎn)化擬南芥，對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了分子檢測。在

11、擬南芥轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)檢測到成熟小RNA的表達(dá)，擬南芥轉(zhuǎn)基因株系根中Atppc4的表達(dá)水平明顯下降，然而其它3個植物型PEPC基因Atppc1、Atppc2和Atppc3在根中的表達(dá)明顯得到上調(diào)。轉(zhuǎn)基因株系根中的PEPC酶活性提高了5.1倍，表明植物中細(xì)菌型和植物型PEPC基因具有互作，細(xì)菌型PEPC基因Atppc4可以調(diào)控植物型PEPC基因的表達(dá)。分析擬南芥株系和對照植株的脂肪酸含量和組分的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系和對照的脂肪酸含量和脂肪酸組

12、分未發(fā)生明顯變化。
　　 5.Atppc4的下調(diào)表達(dá)提高擬南芥的耐鹽能力。在非鹽處理培養(yǎng)基上，Atppc4-ami RNA轉(zhuǎn)基因株系比野生型的根系生長更慢。發(fā)現(xiàn)7日齡轉(zhuǎn)基因株系的長度比野生型株系短29.0％，將這些植株移到含有150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)基因株系長度比野生型株系要短16.3％。說明轉(zhuǎn)基因株系的根系由于Atppc4基因表達(dá)被抑制;鹽處理后轉(zhuǎn)基因株系根的生長能得到部分緩解，從而縮短了與野生型根