油茶ACCase基因的克隆及功能研究.pdf

1、油茶(Camellia oleifera Abel)是中國原產(chǎn)且最為重要的木本食用油料樹種。提高油茶種子含油率是今后很長一段時(shí)間油茶育種的重大目標(biāo)和技術(shù)難關(guān)，而且通過常規(guī)育種技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)宏大目標(biāo)，加速油茶品種改良進(jìn)程，一個(gè)可行的方法就是關(guān)注參與脂肪酸和油脂合成的關(guān)鍵酶，克隆控制油茶種子油含量的關(guān)鍵基因，并通過分子育種的方法對現(xiàn)有品種實(shí)施遺傳改良，達(dá)到提高油茶種子油含量的目的。異質(zhì)型乙酰輔酶A羧化酶是各種脂肪酸從頭合成和油脂

2、合成的限速酶和關(guān)鍵酶，它由生物素羧化酶(BC)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、α-羧基轉(zhuǎn)移酶(α-CT)和β-羧基轉(zhuǎn)移酶(β-CT)4個(gè)亞基組成。本研究以‘華碩’、‘華金’、‘華鑫’、‘衡東號31’、‘衡東65’和‘衡東17號’等6個(gè)品種以及‘華碩’的嫩葉、莖段、花芽、雄蕊、雌蕊、子房、4月份幼果、7月份幼果以及成熟種子為材料，從油茶中克隆了ACCase4個(gè)亞基的cDNA序列和基因組序列，通過多重RT-PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了

3、它們在油茶種子不同發(fā)育階段及不同組織器官中的表達(dá)規(guī)律，并在擬南芥中研究它們的過量表達(dá)和RNA干擾對油脂合成的影響。本研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.油茶ACCase4個(gè)亞基基因的cDNA克隆。以‘華碩’成熟種子總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，采用簡并RT-PCR、5’和3’RACE等技術(shù)克隆了油茶ACCase4個(gè)亞基的cDNA，分別命名為Co-accB(編碼BCCP)、Co-accC(編碼BC)、Co-accA(編碼α-C

4、T)和Co-accD(編碼β-CT)。(1)油茶ACCase亞基基因accB的全長cDNA為1153 bp，編碼272個(gè)氨基酸。并具有前體肽以及與其它三個(gè)亞基結(jié)合形成ACCase復(fù)合體的成熟肽，其前體肽的剪切位點(diǎn)可能位于Ser-64與Ala-65之間；它含有生物素(酰)化模塊CIIEAMNEIE及生物素化位點(diǎn)Lys。(2)油茶BC亞基基因accC的全長cDNA大小為1638 bp，含有1602 bp的開放讀碼框，編碼533個(gè)氨基酸。它具

5、有前體肽以及與其它三個(gè)亞基結(jié)合形成ACCase的成熟肽。其前體肽剪切位點(diǎn)可能位于Arg46-Val47之間。并具有BC-1、ATP結(jié)合位點(diǎn)、BC-2以及生物素?；稽c(diǎn)四個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。(3)油茶ACCase亞基基因accA的部分cDNA序列大小為1293 bp，編碼430個(gè)氨基酸。它具有保守的氨基酸序列，并含有乙酰輔酶A結(jié)合域。(4)在克隆ACCaseβ-CT亞基基因accD時(shí)，獲得了一個(gè)長度為2574 bp的序列，該序列包括1，5-二磷酸

6、核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基基因rbcL(ribulose1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase large subunit)(部分序列)、rbcL-accD以及accD(全長cDNA序列)三部分。其中，accD的ORF為1530 bp，編碼510個(gè)氨基酸。它含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和五個(gè)保守序列。在其ORF推導(dǎo)的氨基酸序列中含有乙酰輔酶A、羧基生物素結(jié)合位點(diǎn)以及位于它們之后的羧基轉(zhuǎn)移酶催化位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)域。rbc

7、L、rbcL-accD基因間隔及accD的核苷酸序列與二十多種山茶屬植物對應(yīng)葉綠體基因的核苷酸序列具有高度一致性，這反映了它們具有較近的親緣關(guān)系。油茶ACCase這4個(gè)亞基基因推導(dǎo)的氨基酸序列與棉花(Gossypium hirsutum)、花生(Arachis hypogaea)和大豆(Glycine max)等油料植物以及大腸桿菌ACCase對應(yīng)亞基基因的氨基酸序列具有較高的一致性，屬于異質(zhì)型ACCase基因；它們具有完成ACCase

8、羧化乙酰CoA兩個(gè)半反應(yīng)以及亞基間相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；核編碼基因accA、accB和accC前體肽剪切后的成熟肽與位于質(zhì)體的β-CT亞基結(jié)合，最終形成具有ACCase活性的多亞基異質(zhì)型復(fù)合體。
　　 2.油茶ACCase BC和β-CT亞基基因基因組DNA的克隆。以油茶‘華碩’葉片總DNA為模板，根據(jù)accC和accD的cDNA序列分別設(shè)計(jì)引物，采用降落PCR技術(shù)，獲得了包括它們基因編碼區(qū)(分別為1602 bp和1533 bp)在

9、內(nèi)的基因組序列。其中，accC的基因組序列長度為1638 bp；rbcL、rbcL-accD以及accD的基因組序列大小為2222 bp；與它們的對應(yīng)cDNA序列比較后確認(rèn)這兩個(gè)基因均沒有內(nèi)含子。accD上游啟動(dòng)區(qū)為約529 bp，沒有PEP啟動(dòng)子位點(diǎn)，含有NEP型啟動(dòng)子元件，其5'端UTR部分含有-10啟動(dòng)子元件、CAAT BOX1、YACT、napA E-box、GATA box和DOFCOREZM等位點(diǎn)，并可能與psaI、ycf4

10、、cemA和petA等形成操縱子，在NEP型啟動(dòng)子控制下以多順反子形式轉(zhuǎn)錄。在油茶基因組中存在于葉綠體或質(zhì)體的β-CT亞基基因和存在于核基因組中的BC亞基基因可能作為‘小基因組’，在基因組進(jìn)化過程中內(nèi)含子逐漸被淘汰。所獲得的accD基因組序列與cDNA序列存在著核苷酸差異，這可能與accD基因家族有關(guān)，也可能與基因組序列轉(zhuǎn)錄過程的RNA編輯現(xiàn)象有關(guān)。獲得油茶ACCase兩個(gè)BC和β-CT亞基基因組序列為油脂合成及油脂含量影響等研究提供了

11、基因材料和理論依據(jù)。
　　 3.油茶ACCase4個(gè)亞基基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)模式研究。以‘華碩’等6個(gè)油茶優(yōu)良品種的成熟種子以及‘華碩’嫩葉等不同組織器官和不同發(fā)育階段的種子為材料，分別以它們的cDNA第一鏈為模板，從GAPDH、Actinl和UBC30等參照基因中選取GAPDH做為參照基因；在優(yōu)化GAPDH與分別油茶ACCase4個(gè)亞基基因accA、accB、accC和accD同管擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系和條件的基礎(chǔ)上，研究了油茶AC

12、Case4個(gè)亞基基因的表達(dá)模式，熒光定量PCR進(jìn)一步證實(shí)和補(bǔ)充了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(1)油茶accB基因在‘華碩’等6個(gè)不同含油率種子中的表達(dá)差異不十分明顯；熒光定量PCR揭示油茶accB基因在‘衡東17號’、‘衡東65號’和‘華碩’轉(zhuǎn)錄水平較高。油茶accB基因在油茶‘華碩’雌蕊和成熟種子中的轉(zhuǎn)錄水平較高。(2)油茶accC基因在‘華碩’等6個(gè)不同含油率種子中的轉(zhuǎn)錄水平差異較為明顯，在‘衡東17號’和‘衡東65’中較多。它的轉(zhuǎn)錄水平與各品種含

13、油率之間的相關(guān)性不十分明顯。(3)油茶accA基因在油茶‘華金’表達(dá)量較多，在‘衡東31號’、‘衡東17號’和‘華鑫’種子中轉(zhuǎn)錄水平相似。其表達(dá)量與各品種含油率之間的相關(guān)性不明顯。它在油茶‘華碩’成熟種子中的表達(dá)量最多，而在其它組織及種子發(fā)育過程中表達(dá)量較少。(4)油茶accD基因在‘華碩’等等不同含油率種子中轉(zhuǎn)錄存在著較大差異，在‘華鑫’中表達(dá)量最大。它的轉(zhuǎn)錄水平與部分油茶品種含油率之間有一定的相關(guān)性。它在油茶‘華碩’的葉片表達(dá)量和發(fā)

14、育的種子中轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　 在油茶種子發(fā)育過程中，這4個(gè)ACCase基因轉(zhuǎn)錄量增多的趨勢符合種子由花期到成熟，油脂合成量由小到多而進(jìn)入高峰期，對脂肪酸需求逐漸增多；種子成熟后，油脂合成逐漸完成，對脂肪酸需求下降的要求。表明這4個(gè)ACCase基因轉(zhuǎn)錄與脂肪酸形成關(guān)系密切。我們的研究結(jié)果支持‘異質(zhì)型ACCase的表達(dá)量對其活性和種子含油量至關(guān)重要，是種子含油率高低標(biāo)志這個(gè)結(jié)論’以及‘ACCase在決定油料作物含油率具有重要作用’

15、這個(gè)假說。油茶異質(zhì)型ACCase各亞基基因協(xié)調(diào)表達(dá)，在開花前(后)和種子成熟前后出現(xiàn)了兩個(gè)轉(zhuǎn)錄高峰，只是前者不明顯，后者卻十分明顯。另外，這4個(gè)基因在油茶組織器官中呈現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)錄水平，這與Ke等的結(jié)論相一致。本研究為我們從轉(zhuǎn)錄水平檢測油茶ACCase亞基基因表達(dá)提供一種直觀的方法。
　　 4.ACCase亞基基因accC的過量表達(dá)和accA/accB/accC/accD的RNA干擾研究。構(gòu)建了pCAMBIAl304-35S-a

16、ccC植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入哥倫比亞野生型擬南芥中，獲得accC過量表達(dá)的轉(zhuǎn)擬南芥T1和T2代抗性植株。利用Gateway技術(shù)，分別構(gòu)建了異質(zhì)型ACCase多亞基基因的干擾載體pJawohRNAi18-accA/accB/accC/accD，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入哥倫比亞野生型擬南芥中分別了獲得它們的T1代轉(zhuǎn)擬南芥抗性植株。這為今后研究異質(zhì)型ACCase基因在種子特異啟動(dòng)子作用下分別與4個(gè)亞基的兩兩組合融合、1個(gè)和3個(gè)組合融合或4個(gè)亞基融

17、合構(gòu)建ACCase過量表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)到植物植株中檢測它們的表達(dá)效果等研究提供理論準(zhǔn)備和物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本研究獲得油茶ACCase4個(gè)亞基基因的cDNA序列和2個(gè)亞基基因組序列，分析了油茶ACCase4個(gè)亞基基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、表達(dá)模式以及它們在脂肪酸和油脂代謝途徑中的作用，為油茶品種評價(jià)和豐產(chǎn)栽培措施的調(diào)控提供了一種直觀的檢測方法。這將對今后提高油茶種子含油率，增加油茶單位面積產(chǎn)量和總產(chǎn)量以及油茶一些豐產(chǎn)栽培措施的應(yīng)用