美洲商陸內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能菌株1Y31強(qiáng)化雜交狼尾草富集錳的機(jī)制研究.pdf

1、由于人類活動(dòng)的影響，環(huán)境中錳污染日益嚴(yán)重。生物修復(fù)是一種成本低、便于操作且環(huán)境友好的新興修復(fù)技術(shù)。植物內(nèi)生細(xì)菌可以利用多種方式影響植物對錳的耐性和富集能力，因此，在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)錳污染過程中植物內(nèi)生細(xì)菌發(fā)揮了極其重要的作用。通過從錳超富集植物美洲商陸中分離和篩選具有促生作用的植物內(nèi)生菌，不僅可以揭示微生物多樣性，豐富微生物資源庫，還可以揭示微生物群落結(jié)構(gòu)與植物富集錳的關(guān)系，為植物內(nèi)生細(xì)菌強(qiáng)化植物修復(fù)錳污染提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。<

2、br>　　本文利用可培養(yǎng)方法研究不同的錳濃度處理(0，1，10 mmol L-1)對水培美洲商陸的根莖葉部內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)、抗性細(xì)菌數(shù)的影響，結(jié)果顯示抗性細(xì)菌數(shù)隨Mn濃度升高呈遞增趨勢。從美洲商陸中共分離內(nèi)生細(xì)菌300株，測定其植物促生特性，研究表明高產(chǎn)IAA（＞20μg ml-1）菌株比例同樣隨Mn處理濃度的升高而呈遞增趨勢。對分離菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究表明美洲商陸可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌主要包括:Firmicutes、Actinobacte

3、ria、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria5個(gè)發(fā)育類群，此外，不同Mn濃度處理對內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，其中1mmol L-1處理下分離的菌株種類最為豐富，且不同組織間差異也很大，其中莖部分離的菌株種類最為豐富。提取細(xì)菌總DNA，采用PCR-DGGE技術(shù)研究不同濃度Mn處理對未培養(yǎng)植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明美洲商陸未培養(yǎng)細(xì)菌主要包括:α-Proteobact

4、eria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、 Cyanobacteria/Chloroplast和Unclassified6個(gè)發(fā)育類群，其中莖部的種群最為豐富。
　　根據(jù)分離菌株的生物學(xué)特性，本實(shí)驗(yàn)挑選分離自美洲商陸葉部的Bacillusmegaterium1Y31作為供試菌株，并以雜交狼尾草作為供試植物，進(jìn)行Mn0和Mn1000 mg kg-1處理土培實(shí)驗(yàn)。結(jié)果

5、表明，接菌處理與接滅活菌對照相比，供試植物生物量提高2.9％-70.2％，雜交狼尾草吸收的Mn提高8.9％-63.9％。同時(shí)接菌處理還提高了雜交狼尾草內(nèi)生、根際土壤和非根際土壤細(xì)菌的總數(shù)和抗性細(xì)菌數(shù)。同時(shí)，接菌處理還提高了雜交狼尾草內(nèi)生、根際土壤和非根際土壤菌株中具有植物促生特性的菌株的比例。另外DGGE結(jié)果表明，供試菌株能夠成功定殖在雜交狼尾草根際土壤中，接菌處理雜交狼尾草根際土壤細(xì)菌種群主要包括Acidobacteria、Actin

6、obacteria、Bacteroidetes等9個(gè)發(fā)育類群，而非根際土壤細(xì)菌種群包括Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi等10個(gè)發(fā)育類群。接菌對不同處理下的植物根際和非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著影響。
　　以雜交狼尾草為供試植物在Mn0，2，10 mmol L-1處理下進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在10 mmol L-1處理下植物Mn含量達(dá)到了10000 mg kg-1以上，達(dá)到了Mn超富

7、集植物的臨界值，且接菌（Bacillus megaterium1Y31）處理可以使雜交狼尾草生物量提高20.6％-93.9％, Mn吸收總量提高22.8％-112％。同時(shí)接菌處理還提高了各Mn處理下根部和葉部內(nèi)生細(xì)菌的總數(shù)和抗性細(xì)菌數(shù)量及具有促生功能細(xì)菌的比例，且根部大于地上部。PCR-DGGE結(jié)果表明供試植物根部內(nèi)生細(xì)菌主要包括Bacteroidetes、Alphaproteobacteria、 Betaproteobacteria、

8、 Gammaproteobacteria、 Firmicutes和Cyanobacteria/Chloroplast6個(gè)發(fā)育類群，且接菌處理對根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，葉部內(nèi)生細(xì)菌主要包括Bacteroidetes、Gammaproteobacteria、Firmicutes和Cyanobacteria/Chloroplast4個(gè)發(fā)育類群，且接菌處理對葉部細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著影響。
　　利用2-DE和MS技術(shù)研究接菌（Bacil

9、lus megaterium1Y31）處理對不同錳濃度處理下水培雜交狼尾草葉部蛋白差異表達(dá)的影響。對照相比，接菌處理雜交狼尾草葉部共鑒定出差異蛋白109個(gè)，其中發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的蛋白分別是66個(gè)和43個(gè)。這些差異蛋白涉及關(guān)于光合作用、能量代謝、環(huán)境刺激、活性氧代謝、新陳代謝、信號(hào)傳遞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持、蛋白翻譯、加工和降解和未歸類共9大類型的蛋白。在非脅迫下(Mn0 mmol L-1)，差異蛋白只涉及光合作用、能量代謝、環(huán)境刺激、蛋白翻譯、加

10、工和降解和未歸類5大類別;接菌處理使葉綠體ab結(jié)合蛋白、RuBisCO等涉及集光和碳固定的蛋白發(fā)生上調(diào)，說明菌株1Y31可以提高植物光合作用效率，接菌還促使ATP合酶亞基蛋白、1，7-二磷酸-景天庚酮糖和轉(zhuǎn)酮醇酶等涉及直接生成ATP的關(guān)鍵酶同樣發(fā)生上調(diào)，說明菌株1Y31可以在非脅迫下提高雜交狼尾草光合作用和能量合成效率。在錳脅迫下（Mn2和Mn10 mmol L-1），差異蛋白則涉及關(guān)于光合作用、能量代謝、環(huán)境刺激、活性氧代謝、新陳代謝

11、、信號(hào)傳遞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持、蛋白翻譯、加工和降解和未歸類共9大類別，說明錳脅迫對雜交狼尾草葉片蛋白的差異表達(dá)有顯著影響;接菌處理使葉綠體ab結(jié)合蛋白、RuBisCO、放氧增強(qiáng)蛋白和RuBisCO活化酶等涉及到集光、固碳、光合放氧和活化RuBisCO等功能的蛋白發(fā)生上調(diào)，接菌還促使ATP合酶亞基、檸檬酸縮合酶、磷酸雙激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羥化酶等直接或通過三羧酸循環(huán)間接產(chǎn)生ATP的蛋白發(fā)生上調(diào)，5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、