美洲商陸抗病毒蛋白Ⅰ和Ⅱ基因功能的研究及葉片中抗病毒蛋白的分離.pdf

1、美洲商陸抗病毒蛋白(PAPs)是一類能很好的抑制植物病毒的蛋白,很早就有報(bào)道低劑量的商陸葉片粗粉末就能明顯的抑制TMV在菜豆葉片上局部枯斑的形成,PAP緩釋劑也已用于病毒病的防治工作,但美洲商陸抗病毒蛋白屬于核糖體失活蛋白,它對生長的細(xì)胞會有一定的毒性.該實(shí)驗(yàn)通過將PAP基因進(jìn)行N-端信號肽的缺失和N-,C-兩端都缺失,并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),而且獲得了兩個有活性的表達(dá)蛋白,體外生物測定表明表達(dá)蛋白具有抑制TMV的活性,而對植物本身沒

2、有毒性,轉(zhuǎn)PAP缺失型基因的煙草也表現(xiàn)出對TMV的抑制作用,它可以使煙草發(fā)病延遲20-25天,而且轉(zhuǎn)缺失基因的煙草生長狀況良好.由于美洲商陸抗病毒蛋白Ⅱ(PAPⅡ)是一個受季節(jié)調(diào)控表達(dá)的蛋白,該實(shí)驗(yàn)以美洲商陸夏季葉片為材料,通過對其總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、并用PAPⅡ的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對PAPⅡ進(jìn)行了基因克隆、序列分析,結(jié)果擴(kuò)增出來的PAPⅡ基因與已經(jīng)報(bào)道的序列同源性是99.9﹪,然后將該基因構(gòu)建到原核、真核表達(dá)載體上,分別轉(zhuǎn)化

3、了大腸桿菌和畢赤酵母并對它們進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),在兩個表達(dá)系統(tǒng)中均獲得了有活性的PAPⅡ表達(dá)蛋白,體外生物測定表明表達(dá)的蛋白均具有抑制病毒的活性,PAPⅡ基因在酵母中還沒有表達(dá)的報(bào)道,這為獲得具活性PAPⅡ蛋白提供了一種簡便可行的方法.據(jù)報(bào)道美洲商陸抗病毒蛋白是在美洲商陸不同組織和不同生長時期合成的一類蛋白,在葉片中已經(jīng)純化出三種抗病毒蛋白,它們是PAPⅠ,PAPⅡ,PAPⅢ.對美洲商陸春季、夏季、秋季采集的葉片,用50-80﹪飽和度硫酸銨

4、沉淀出來的蛋白樣品,經(jīng)過SP陽離子柱后,上MQ陰離子柱,然后把活性蛋白峰再上MS陽離子柱或MQ陰離子柱分離,從春季葉片中分離出四個不同的抗病毒蛋白峰;從夏季葉片中分離出二個不同的抗病毒蛋白峰,這兩個蛋白峰與春季葉片中分離出的活性蛋白峰都能重疊上;但從秋季葉片中只分離出來一個抗病毒蛋白峰,它和春季、夏季葉片中分離出的活性蛋白峰都重疊不上.可以認(rèn)為在美洲商陸的葉片中可能還有新的抗病毒蛋白,并且多于目前已經(jīng)報(bào)道的三個,但這需要大量分離、提純蛋