美洲商陸抗病毒蛋白-Ⅱ基因的克隆和表達.pdf

1、[目的]:美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweedantiviralproteins，PAPs)是在美洲商陸(phytolaccaamercana)的不同組織或不同生長階段合成的一類具有酶功能的核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingproteins，RIPs)，有多種類型，即PAP-Ⅰ，PAP-Ⅱ，PAP-Ⅲ，PAP-S，PAP-R，分別來自春天的葉片、初夏的葉片、晚夏的葉片、種子、根。美洲商陸抗病毒蛋白-Ⅱ(pokew

2、eedantiviralproteinⅡ)，具有RNAN-糖苷酶的活性，能專一地從真核生物核糖體28SrRNA的第4324位和原核生物核糖體23SrRNA的第2600位切下一腺嘌呤，干擾延伸因子EF-2催化GTP的水解，從而阻礙了蛋白質(zhì)的合成。最近的研究表明PAP-Ⅱ蛋白能抑制HIV病毒在內(nèi)的多種病毒，也有研究將其構(gòu)建成免疫毒素，用于殺傷腫瘤細胞。本實驗室利用基因工程方法，從新鮮的美洲商陸夏季的葉片中成功的克隆了PAP-Ⅱ的基因，插入到

3、原核表達載體，并在大腸桿菌BL21中成功地表達了PAP-Ⅱ蛋白，為進一步研究PAP-Ⅱ的抗病毒、抗腫瘤的作用機理提供研究平臺。 [方法]:根據(jù)報道的cDNA序列，設(shè)計合成兩條引物，在兩條引物上分別添加HindⅢ、NdeⅠ酶切位點，用RT-PCR的方法從夏季的美洲商陸新鮮的葉片中克隆PAP-Ⅱ基因，與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，經(jīng)過NdeⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定陽性亞克隆，送生工測序。對確定含有PAP-Ⅱ基因

4、的陽性亞克隆，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ對陽性亞克隆產(chǎn)物雙酶切，目的基因片段切膠回收，與經(jīng)相同酶切的pET-28a-c(+)載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，挑選陽性克隆，小量表達鑒定重組表達質(zhì)粒。將含有正確表達質(zhì)粒pET-PAP-Ⅱ的轉(zhuǎn)化菌BL21(DE3)用IPTG誘導(dǎo)表達，收集菌體沉淀，重懸超聲破菌，將超聲所得沉淀反復(fù)洗滌，8M的尿素溶解包涵體，透析復(fù)性。復(fù)性蛋白溶液用BBSTNTA樹脂親和層析純化，經(jīng)SDS-P

5、AGE電泳檢測，用非放射性基于ELISA方法檢測經(jīng)過復(fù)性純化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A鏈(RTA)在體外對HIV-1整合酶的抑制活性，用MTT法檢測PAP-Ⅱ蛋白對HEP-G2和Hela細胞毒性。 [結(jié)果]:RT-PCR產(chǎn)物與預(yù)計的目的片段長度大小一致。RT-PCR產(chǎn)物與T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，抽提質(zhì)粒用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切確認陽性質(zhì)粒，經(jīng)測序證實該片段序列與所報道的序列完全一致。 重組表達質(zhì)粒pET

6、-PAP-Ⅱ用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳?？梢娪心康臈l帶片段，說明PAP-Ⅱ的編碼基因已插入pET-28a-c(+)。含重組表達質(zhì)粒pET-PAP-Ⅱ的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，在表達的過程中發(fā)現(xiàn)BL21(DE3)細菌的生長明顯受到抑制。表達后的菌液及菌體超聲破菌后沉淀和上清12％SDS-PAGE電泳，經(jīng)誘導(dǎo)菌液泳道及超聲沉淀泳道均可見一分子量約為35kD的蛋白條帶，而未誘導(dǎo)菌液與超聲上清無相應(yīng)條

7、帶，這說明PAP-Ⅱ蛋白以包涵體形式正確表達。包涵體反復(fù)洗滌后，用8M尿素溶解，透析復(fù)性所得產(chǎn)物，經(jīng)BBSTNTA樹脂純化，SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示其純度較高。用非放射性基于ELISA方法檢測經(jīng)過復(fù)性純化后PAP-Ⅱ蛋白和蓖麻毒素A鏈(RTA)在體外對HIV-1整合酶有較強的抑制活性，其IC50分別約為303μg/ml，220μg/ml。用MTT法分析PAP-Ⅱ蛋白的生物學(xué)活性，復(fù)性純化后蛋白對HEP-G2和Hela細胞有細胞毒作