過表達(dá)Axl在高糖缺氧條件下調(diào)控HIF-1α表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮成管的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：高糖下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）的表達(dá)，進(jìn)而抑制缺氧狀態(tài)下血管新生。Axl能調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)內(nèi)皮成管，然而 Axl是否參與高糖缺氧條件下內(nèi)皮成管及HIF-1α的調(diào)控尚不清楚。本實驗擬觀察高糖對缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞成管作用及Axl表達(dá)的影響，檢測過表達(dá)Axl對高糖缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞成管作用的影響及HIF-1α表達(dá)的調(diào)控作用。
　　方法：1.給予人臍靜脈內(nèi)皮

2、細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（Eahy926）不同濃度葡萄糖（5.5 mmol/l、11 mmol/l、25 mmol/l和30mmol/l）處理，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，MTT檢測高糖對細(xì)胞活性的影響；2.在高糖條件下給予HUVECs和Eahy926細(xì)胞不同時間缺氧處理，MTT檢測缺氧時間對細(xì)胞活性的影響；3.摸索出合適的高糖缺氧條

3、件后，實驗分為高糖缺氧組和對照組（單純?nèi)毖踅M），用劃痕實驗和體外基質(zhì)膠成管實驗檢測高糖對缺氧狀態(tài)下HUVECs和Eahy926細(xì)胞遷移和管腔形成能力的影響；4.Western blot方法檢測高糖對缺氧狀態(tài)下HUVECs和Eahy926細(xì)胞Axl、HIF-1α蛋白表達(dá)的影響；5.構(gòu)建Axl過表達(dá)慢病毒并轉(zhuǎn)染Eahy926細(xì)胞，用Western blot檢測細(xì)胞中Axl的表達(dá)情況；6.病毒轉(zhuǎn)染成功后，將實驗分為四組：對照組（陰性病毒）、A

4、xl過表達(dá)組、R428組（Axl抑制劑R428+陰性病毒）、Axl過表達(dá)+R428組。劃痕實驗和體外基質(zhì)膠成管實驗檢測過表達(dá)Axl對高糖缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞遷移和成管作用的影響；7.實時熒光定量 PCR和Western blot檢測過表達(dá)Axl對HIF-1αmRNA及蛋白含量的影響；8.使用蛋白合成抑制劑放線菌酮（Cycloheximide，CHX）、PI3K抑制劑LY294002，MEK抑制劑PD98059和mTOR抑制劑Rapamyc

5、in，應(yīng)用Western blot檢測過表達(dá)Axl調(diào)控HIF-1α表達(dá)的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：1.葡萄糖對內(nèi)皮細(xì)胞活性的抑制呈濃度和時間依賴性，30 mmol/l葡萄糖處理HUVECs或Eahy926細(xì)胞48小時，能顯著抑制細(xì)胞活性；2.缺氧時間對高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞活性呈時間依賴性，高糖狀態(tài)下，缺氧12 h和24 h組與單純高糖組相比，內(nèi)皮細(xì)胞活性均顯著降低；3.在HUVECs和Eahy926細(xì)胞中，高糖24 h+缺氧6 h遷移距

6、離均少于缺氧6 h組，HUVECs兩組遷移距離分別為182.9±14.6和303.1±10.8，Eahy926兩組遷移距離分別為190.7±24.8和293.4±23.9，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖24 h+缺氧6 h組小管數(shù)目少于缺氧6 h組，兩種細(xì)胞成管分別減少了30.8％和52.9%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；4.在HUVECs和Eahy926細(xì)胞中，高糖缺氧組的Axl蛋白表達(dá)量比單純?nèi)毖踅MAxl蛋白表達(dá)量

7、少，兩種細(xì)胞分別減少了48.4%和47.1%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在 Eahy926細(xì)胞中，高糖缺氧組的HIF-1α蛋白表達(dá)量比單純?nèi)毖踅M減少了40.7%（P＜0.05）；5.轉(zhuǎn)染過表達(dá)Axl慢病毒后，Eahy926細(xì)胞的Axl蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；6.過表達(dá)Axl組（231.3±20.6）細(xì)胞遷移距離比對照組（179.5±28.9）長（P＜0.05）；過表達(dá)Axl組的小管數(shù)目比對照組多66.8%（P＜0.05）；7.實時熒

8、光定量PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)Axl并不影響HIF-1α的mRNA表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)Axl組HIF-1α蛋白表達(dá)增加了90.6%（P＜0.05）；8. Axl過表達(dá)+CHX組與Axl過表達(dá)組相比，HIF-1α的蛋白表達(dá)減少了95%（P＜0.05），而CHX組與對照組相比變化不明顯，說明蛋白合成途徑參與過表達(dá)Axl導(dǎo)致的HIF-1α表達(dá)增加；過表達(dá)Axl能激活A(yù)kt、p70S6K磷酸化，對Erk磷酸