HIF-1在缺氧誘導(dǎo)胃癌MDR中的機(jī)制研究.pdf

1、缺氧是實(shí)體瘤中普遍存在的現(xiàn)象，可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗，是實(shí)體瘤患者化療失敗最重要的原因之一。缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，有多種分子的參與，盡管目前對(duì)缺氧誘導(dǎo)耐藥的研究已進(jìn)行多年，但仍未發(fā)現(xiàn)行之有效的逆轉(zhuǎn)方法。這是由于其分子機(jī)制仍未完全闡明，更重要的是未能找到諸多耐藥相關(guān)基因的上游調(diào)控分子。因此，闡明其分子機(jī)制并尋找從缺氧發(fā)生到出現(xiàn)耐藥表型形成過(guò)程中的關(guān)鍵分子，將其作為靶點(diǎn)來(lái)逆轉(zhuǎn)實(shí)體瘤耐藥，將為治療腫瘤開辟新的道路

2、。近年來(lái)，有研究報(bào)道提示缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)可能是缺氧誘導(dǎo)實(shí)體瘤多藥耐藥的一個(gè)關(guān)鍵分子。因此，深入探討HIF-1 在缺氧誘導(dǎo)胃癌多藥耐藥中的作用及其分子機(jī)制，將有助于全面深入地理解缺氧誘導(dǎo)胃癌MDR 發(fā)生的過(guò)程和調(diào)節(jié)機(jī)制。 目的： 研究缺氧條件下胃癌細(xì)胞對(duì)于多種化療藥物的耐受性，檢測(cè)缺氧條件下胃癌細(xì)胞中HIF-1 的表達(dá)以及缺氧誘導(dǎo)HIF-1 的上游信號(hào)通路

3、；構(gòu)建HIF-1表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的胃癌細(xì)胞亞系，研究HIF-1 在缺氧誘導(dǎo)胃癌MDR 中的作用；并進(jìn)一步探討HIF-1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游的耐藥相關(guān)分子的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文進(jìn)一步明確HIF-1 在缺氧誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥中的作用機(jī)制；以HIF-1 為靶點(diǎn)進(jìn)行體內(nèi)藥物逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，為HIF-1 作為逆轉(zhuǎn)缺氧條件下實(shí)體瘤MDR 的增敏劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1. 通過(guò)MTT 比色法、Annexin V/PI 染色

4、法和阿霉素潴留和蓄積試驗(yàn)檢測(cè)缺氧和常氧狀態(tài)下胃癌細(xì)胞對(duì)于不同化療藥物的藥物敏感性； 2.利用Western blot 和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HIF-1 的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性； 3. 利用半定量RT-PCR 和ELISA 方法檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)下的VEGF 的mRNA 和蛋白表達(dá)； 4. 利用Western blot 和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)缺氧條件下磷酸化AKT、p42/44 MAPK(

5、ERK1/2) 水平，以及使用PI3K特異性抑制劑LY294002（5、10 μM）和MEK 特異性抑制劑U0126 (1、10μM）后其下游激酶AKT 和p42/44 MAPK(ERK1/2) 的磷酸化水平的變化以及HIF-1 表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的變化； 5. 利用半定量RT-PCR、ELISA 和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)缺氧條件下使用PI3K 特異性抑制劑LY294002（5、10μM）和MEK 特異性抑制劑U0126 (1

6、、10μM）后VEGF 的mRNA、蛋白表達(dá)以及EPO 的熒光素酶活性； 6. 通過(guò)MTT 比色法檢測(cè)HIF-1 上調(diào)和HIF-1下調(diào)的胃癌細(xì)胞在常氧和缺氧條件下對(duì)于不同化療藥物的敏感性；通過(guò)Annexin V/PI 染色法檢測(cè)HIF-1 上調(diào)和HIF-1 下調(diào)的胃癌細(xì)胞系對(duì)于化療藥物誘導(dǎo)的凋亡的影響，并計(jì)算凋亡指數(shù)；借助流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)HIF-1上調(diào)和HIF-1 下調(diào)的胃癌細(xì)胞系內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留，并計(jì)算相應(yīng)的藥物

7、泵出率； 7. 利用RT-PCR 和Western blot 方法檢測(cè)缺氧條件下以及轉(zhuǎn)染HIF-1正義表達(dá)載體和小干擾RNA 載體的細(xì)胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax 和MGr1-Ag 的表達(dá)水平； 8. 利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、染色質(zhì)免疫共沉淀、電泳遷移率試驗(yàn)檢測(cè)HIF-1 對(duì)MGr1-Ag 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制； 9. 通過(guò)細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、MTT 比色法和Annexin V/PI 染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染MG

8、r1-Ag siRNA 的胃癌細(xì)胞在缺氧條件下的細(xì)胞黏附狀態(tài)以及對(duì)于不同化療的藥物敏感性及凋亡指數(shù)的變化； 10. 通過(guò)構(gòu)建人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR 的裸鼠移植瘤模型，觀察以HIF-1 為靶點(diǎn)的小干擾RNA 對(duì)于SGC7901/VCR 耐藥性的體內(nèi)逆轉(zhuǎn)效果；通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法，檢測(cè)各處理組移植瘤內(nèi)HIF-1 的表達(dá)水平。 通過(guò)Western Blot 檢測(cè)各處理組移植瘤內(nèi)HIF-1 的蛋白表達(dá)。

9、 結(jié)果： 1. 與常氧狀態(tài)細(xì)胞相比，缺氧能夠降低胃癌細(xì)胞對(duì)于不同化療藥物的敏感性，減少化療藥物誘導(dǎo)的凋亡和細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留（p<0.05）； 2.缺氧能夠誘導(dǎo)不同胃癌細(xì)胞系HIF-1 的蛋白和轉(zhuǎn)錄活性，且呈時(shí)間依賴性的增加。缺氧還能夠誘導(dǎo)不同的胃癌細(xì)胞系中HIF-1 的下游靶基因VEGF 的mRNA 和蛋白水平以及EPO 的熒光素酶活性； 3. 缺氧能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系中磷酸化AKT、p42/44M

10、APK(ERK1/2)的表達(dá)； 4. PI3K 和MEK的抑制劑LY294002 和U0126 能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的磷酸化AKT 和ERK1/2表達(dá)，進(jìn)而抑制了HIF-1 的表達(dá)和活性； 5. LY294002 和U0126 抑制缺氧誘導(dǎo)的VEGF 的mRNA 和蛋白水平以及EPO 的熒光素酶活性； 6. 與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染正義HIF-1 表達(dá)載體的胃癌細(xì)胞對(duì)于不同化療藥物的敏感性明顯降低，化療藥物誘導(dǎo)的凋

11、亡指數(shù)明顯減少，轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 的表達(dá)顯著增強(qiáng)，Bax 表達(dá)顯著減弱；細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留均明顯減少，細(xì)胞內(nèi)P-gp、MRP 的表達(dá)明顯增加（p<0.05）。轉(zhuǎn)染HIF-1siRNA 細(xì)胞能夠明顯逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的化療藥物的抵抗，化療藥物誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)明顯增加，Bcl-2 的表達(dá)顯著減弱，Bax 表達(dá)顯著增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留均明顯增加，細(xì)胞內(nèi)P-gp、MRP 的表達(dá)明顯降低（p<0.05）； 7. 缺氧能夠上調(diào)

12、MGr1-Ag的表達(dá)，抑制HIF-1 的表達(dá)能夠明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的MGr1-Ag 的mRNA 和蛋白水平； 8. 在MGr1-Ag 啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游-16 的區(qū)域有HIF-1 的缺氧反應(yīng)元件的結(jié)合序列5’-ACGTG-3’，HIF-1 能夠與該元件結(jié)合從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能； 9. 缺氧能夠顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞黏附與基質(zhì)的能力，而轉(zhuǎn)染了MGr1-Ag siRNA 的胃癌細(xì)胞的黏附能力顯著下降。與對(duì)照細(xì)胞相

13、比，轉(zhuǎn)染了MGr1-Ag siRNA 的胃癌細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)缺氧所致的化療藥物耐受和增加化療藥物誘導(dǎo)的凋亡。 10. 與各種對(duì)照組相比，以HIF-1 為靶點(diǎn)的小干擾RNA可以明顯增強(qiáng)人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR 的裸鼠移植瘤對(duì)于長(zhǎng)春新堿的敏感性，移植瘤體積顯著減?。╬<0.05），移植瘤組織內(nèi)HIF-1 的表達(dá)下降，Western Blot 結(jié)果顯示，移植瘤內(nèi)HIF-1 表達(dá)水平明顯下調(diào)（p<0.05）。 結(jié)論：

14、 1.缺氧能夠顯著降低化療藥物的敏感性； 2.胃癌細(xì)胞在缺氧條件下，通過(guò)活化PI3K/AKT 和MEK-p42/44MAPK(ERK1/2) 信號(hào)通路途徑介導(dǎo)了HIF-1 的穩(wěn)定表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活化，并進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)于化療藥物的耐受性； 3.缺氧誘導(dǎo)的HIF-1 依賴性MDR是通過(guò)上調(diào)Bcl-2 和下調(diào)Bax 降低化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，以及通過(guò)上調(diào)p-gp 和MRP 的表達(dá)而減少了化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的潴留和蓄積來(lái)實(shí)現(xiàn)的；