低氧高糖環(huán)境下載HIF-1αsiRNA納米粒的MSCs對(duì)RPE細(xì)胞生物學(xué)特性及HIF-1α表達(dá)的影響研究.pdf

1、目的:
　　探討使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）作為細(xì)胞載體搭載包埋缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）siRNA的聚乳酸聚乙醇酸納米粒（PLGA NPs）對(duì)模擬糖尿病微環(huán)境刺激下視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞的影響。
　?。?）原代培養(yǎng)人MSCs并鑒定，在低氧高糖環(huán)境下對(duì)MSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行觀察；
　?。?）使用PLGA包載人HIF-1αsiRNA并評(píng)測(cè)納米粒相關(guān)指標(biāo)以及觀察MSCs的入胞情況；
　?。?）檢測(cè)

2、PLGA納米粒對(duì)RPE細(xì)胞HIF-1α的沉默情況；
　　（4）觀察載有包埋HIF-1αsiRNA納米粒的MSCs對(duì)低氧高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞生物學(xué)特性以及HIF-1α的mRNA表達(dá)的影響。
　　方法:
　?。?）使用密度離心法提取人MSCs，通過(guò)成骨和成脂誘導(dǎo)后分別使用茜素紅和油紅O進(jìn)行染色鑒定。流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)記物。通過(guò)物理性缺氧模型（低氧CO2培養(yǎng)箱）以及葡萄糖建立低氧高糖模型，按照氧濃度及糖濃度將實(shí)驗(yàn)分為：A

3、.常氧常糖組（21％O2+5.56mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）；B.常氧高糖組（21%O2+30mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）；C.低氧常糖組（5%O2+5.56mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）；D.低氧高糖組（5%O2+30mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）。使用CCK-8在12h、24h和48h分別檢測(cè)MSCs的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)在24 h檢測(cè)MSCs凋亡情況，Transwell在24h檢測(cè)MSCs移行情況；
　

4、　（2）由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建針對(duì)人NM_001530（HIF-1α）基因的質(zhì)粒和慢病毒，乳化-揮發(fā)法制備載HIF-1αsiRNA的PLGA納米粒，激光粒度分析及Zeta電位分析檢測(cè)PLGA納米粒的粒度分布范圍，掃描電鏡觀察納米粒表面形態(tài)；使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染載有HIF-1αsiRNA的MSCs的入胞率進(jìn)行檢測(cè)；
　?。?）將實(shí)驗(yàn)分為：A.陰性對(duì)照組（不做任何處理）；B.慢病毒組（使用構(gòu)建好的慢病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染）；C.裸質(zhì)粒組（使用

5、構(gòu)建好的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染）；D.空白PLGA組（使用γ射線消毒過(guò)的，不含質(zhì)粒的PLGA納米粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染）；E.PLGA+siRNA組（使用γ射線消毒過(guò)的，包埋有HIF-1αsiRNA的納米粒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染）。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)1d、3d、7d時(shí)RPE細(xì)胞中HIF-1αmRNA的相對(duì)表達(dá)量；
　?。?）使用Transwell建立MSCs/RPE細(xì)胞共培養(yǎng)體系，將實(shí)驗(yàn)分為：A.RPE組（在低氧高糖環(huán)境下對(duì)單純的RPE細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)

6、并檢測(cè)）；B.共培養(yǎng)組（在低氧高糖環(huán)境下對(duì)MSCs+RPE細(xì)胞共培養(yǎng)模型進(jìn)行培養(yǎng)并檢測(cè)）；C.載PLGA+siRNA共培養(yǎng)組（在低氧高糖環(huán)境下對(duì)搭載有含HIF-1αsiRNA納米粒的MSCs+RPE細(xì)胞共培養(yǎng)模型進(jìn)行培養(yǎng)并檢測(cè)）。使用CCK-8在12h、24h和48h分別檢測(cè)RPE細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)在24h檢測(cè)RPE細(xì)胞的凋亡情況，Transwell在24h檢測(cè)RPE細(xì)胞的移行情況；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)1d、3d、7d時(shí)RPE細(xì)胞

7、中HIF-1αmRNA的水平。
　　結(jié)果:
　?。?）提取的人MSCs呈貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定具有向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞多向分化的潛能。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記物顯示：CD29（+），CD34（－），CD45（－）。低氧高糖組較常氧常糖組 MSCs的增殖能力（2.25±0.14vs1.28±0.16；3.14±0.19vs1.88±0.11）在24h和48h時(shí)和移行（130±7.07vs72±5.66）能力在24h均增強(qiáng)（P<0.05

8、），凋亡情況無(wú)差異（P>0.05）；
　?。?）納米粒呈窄分布，平均粒徑為314.1nm，Zeta電位為﹣0.36mV。掃描電鏡觀察納米粒表面光滑，呈球形。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)納米粒入胞率為（67.3±5.2）%；
　?。?）相較慢病毒組（<3d）而言，PLGA組可長(zhǎng)期（7d）對(duì)RPE細(xì)胞中HIF-1αmRNA的表達(dá)進(jìn)行有效抑制（7d時(shí)HIF-1αmRNA表達(dá)量：1.13±0.27（慢病毒組）vs0.63±0.23（PLGA組）；

9、F=37.48，P<0.05），抑制率可達(dá)到30-50%，單純質(zhì)粒組以及空白PLGA組與陰性對(duì)照組的結(jié)果一致（F=2.74，P>0.05）。
　?。?）在體外共培養(yǎng)體系中，與單純RPE細(xì)胞組及不載藥的共培養(yǎng)組相比，載藥的共培養(yǎng)組對(duì)低氧高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞的增殖，凋亡及移行的影響均沒(méi)有差異（P>0.05）；1d、3d和7d時(shí)，載有PLGA緩釋載藥系統(tǒng)的MSCs作為載體可較長(zhǎng)期、有效的沉默RPE細(xì)胞中HIF-1αmRNA的表達(dá)（F=4