當(dāng)歸多糖肝靶向作用及保護(hù)急性肝損傷機(jī)理的研究.pdf

1、當(dāng)歸，為傘形科多年生草本植物Angelica sinesis(Oliv.）Diels的干燥根，主要產(chǎn)地為我國甘肅岷縣。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，當(dāng)歸作為補(bǔ)血活血及調(diào)經(jīng)止痛的要藥被廣泛使用。當(dāng)歸多糖（Angelica Polysaccharide）是從當(dāng)歸根中提取出的一種水溶性多糖，也是當(dāng)歸的主要活性成分之一。近年來的研究表明，當(dāng)歸多糖有著顯著的補(bǔ)血補(bǔ)鐵及促進(jìn)機(jī)體免疫的作用，同時(shí)也對(duì)保護(hù)肝功能有著獨(dú)特的療效，但其作用機(jī)理尚不明確。
　　以當(dāng)歸

2、的干燥根部為原料，采用水提醇沉法提取粗多糖，并經(jīng)純化得到精制當(dāng)歸多糖ASP。通過化學(xué)及光譜圖譜對(duì)所得產(chǎn)物的純度和初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。用熒光物質(zhì)標(biāo)記ASP，考察其在大鼠肝臟組織的分布情況、不同濃度下的分子粒徑大小及對(duì)Toll樣受體和甘露糖受體的結(jié)合作用，探討AS P對(duì)肝臟的靶向作用。建立刀豆蛋白致肝損傷及酒精性肝損傷兩種急性肝損傷模型，通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)考察AS P對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為增加ASP的臨床應(yīng)用范圍及藥效機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和

3、理論基礎(chǔ)。
　　第一部分當(dāng)歸多糖的肝靶向作用研究
　　采用傳統(tǒng)的水提醇沉法從當(dāng)歸飲片中提取粗多糖，并通過反復(fù)凍融、微孔濾膜過濾法及Sephadex G-50色譜層析柱分離純化，得到白色絮狀固體ASP。紫外可見光光譜顯示ASP不含核酸和蛋白質(zhì)，由紅外光譜所示特征吸收峰推測(cè)ASP為β-D吡喃糖，苯酚-硫酸法測(cè)定其糖含量為90.25％，高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定其重均分子量（MW）為9.4×104 Da。
　　AS

4、P經(jīng)FITC標(biāo)記后得橙黃色絮狀標(biāo)記產(chǎn)物（FITC-ASP，F(xiàn)A）。FA產(chǎn)率穩(wěn)定，在紫外可見光及熒光掃描圖譜中可見典型的熒光素FITC的特征吸收峰，并且在PBS溶液及血漿中穩(wěn)定性較好，熒光標(biāo)記取代度適宜，可成為研究當(dāng)歸多糖肝靶向作用的工具。
　　體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)采用四種濃度劑量（3、6、12及24 mg/kg）的FA經(jīng)尾靜脈注射SD大鼠，在給藥0.25、0.5、1、1.5、2、3和4 h時(shí)采用高效液相色譜儀檢測(cè)肝臟勻漿液的熒光強(qiáng)度。結(jié)果

5、顯示，給藥后FA迅速分布到肝臟組織并蓄積，至約1.5 h左右達(dá)到峰值。隨后，肝臟組織中FA的濃度逐漸下降，至4 h后基本從肝臟組織中清除。
　　原子力顯微鏡和布魯克海文粒度儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASP的濃度為1μg/mL至20 mg/mL時(shí)，ASP在溶液中分散均勻，穩(wěn)定性較好，其粒徑在200 nm到3μm之間，在肝臟的被動(dòng)靶向粒徑范圍內(nèi)，可被肝巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）攝取而聚集于肝臟組織，產(chǎn)生被動(dòng)靶向肝臟的作用。
　　Kup

6、ffer細(xì)胞TLR4及甘露糖受體的體外拮抗實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Kupffer細(xì)胞可以通過甘露糖受體與當(dāng)歸多糖ASP產(chǎn)生特異性結(jié)合作用，而Kupffer細(xì)胞上的TLR4與ASP并沒有明顯的結(jié)合作用。上述結(jié)果表明，AS P可通過與甘露糖受體結(jié)合產(chǎn)生部分主動(dòng)肝靶向作用，為后續(xù)當(dāng)歸多糖對(duì)急性肝損傷保護(hù)作用的研究提供實(shí)驗(yàn)思路及理論基礎(chǔ)。
　　第二部分當(dāng)歸多糖對(duì)刀豆蛋白致急性肝損傷小鼠肝保護(hù)作用機(jī)理研究
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用刀豆蛋白誘導(dǎo)急性肝損傷模型

7、：將小鼠隨機(jī)分組，低劑量給藥組小鼠每日單次尾靜脈注射ASP1.5 mg/kg；高劑量給藥組及ASP毒性試驗(yàn)組小鼠每日單次尾靜脈注射 ASP6 mg/kg；正常對(duì)照組及模型組小鼠每日單次尾靜脈注射等體積PBS。連續(xù)給藥14天，于第15天誘導(dǎo)損傷，即模型組及低、高劑量給藥組小鼠單次尾靜脈注射ConA15 mg/kg；正常對(duì)照組及ASP毒性試驗(yàn)小鼠單次尾靜脈注射等體積0.01 M PBS。造模8 h后采用眶動(dòng)靜脈取血法采集血液。造模20 h后

8、稱量并記錄小鼠體重，處死小鼠后取出肝臟組織，均分并分別采用多聚甲醛固定及-80℃冷凍處理。
　　通過觀察肝臟表觀形態(tài)、蘇木精-伊紅染色切片顯微圖片及計(jì)算各組小鼠肝指數(shù)和轉(zhuǎn)氨酶水平考察 ASP對(duì)刀豆蛋白致急性肝損傷的保護(hù)作用。觀察肝臟表觀形態(tài)可見，造模后小鼠肝臟顏色發(fā)黑變暗，有嚴(yán)重的血液淤積現(xiàn)象；低、高劑量給藥組小鼠肝臟顏色較模型組均有所恢復(fù)。由蘇木精-伊紅染色圖片可以觀察到，ConA致急性肝損傷模型建立后，小鼠肝臟組織出現(xiàn)大面積壞

9、死、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞破碎，匯管區(qū)及肝實(shí)質(zhì)內(nèi)有嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；相比于模型組，低、高劑量給藥組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)趨于完整，無明顯的壞死區(qū)域，匯管區(qū)和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。計(jì)算肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，ConA模型組小鼠肝指數(shù)從4.32%上升為6.08%，而經(jīng)ASP預(yù)給藥的兩組小鼠肝指數(shù)較ConA模型組均明顯降低。血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ConA模型組小鼠血清AST及ALT較正常對(duì)照組小鼠顯著上升了近千倍，而低、高劑量給藥組小鼠

10、血清AST及ALT水平較ConA模型組均有極顯著降低。以上結(jié)果表明，AS P對(duì)刀豆蛋白致急性肝損傷有良好的肝保護(hù)作用。AS P毒性試驗(yàn)組小鼠各指標(biāo)與正常對(duì)照組相比并沒有顯著改變，證實(shí)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的劑量濃度下ASP對(duì)小鼠無毒副作用。
　　采用檢測(cè)試劑盒和雙抗體夾心 ELISA法探究 ASP對(duì)模型小鼠血清細(xì)胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-2和IL-6）及抗氧化相關(guān)指標(biāo)（SOD、ROS和MDA）的影響。由結(jié)果可知，ConA模型組小鼠

11、血清免疫相關(guān)細(xì)胞因子 TNF-α，IFN-γ，IL-2和 IL-6與正常對(duì)照組相比顯著升高，體內(nèi)ROS及MDA水平均異常增加，而SOD酶活力明顯降低；與ConA模型組相比，低、高劑量組小鼠TNF-α，IFN-γ，IL-2和IL-6水平均有顯著降低，體內(nèi)ROS及MDA水平明顯下降，而SOD酶活力顯著增加。上述結(jié)果顯示，預(yù)給藥AS P能夠有效地抑制刀豆蛋白引起的機(jī)體免疫炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化能力，從而減輕刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝損傷。

12、>　　采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) ASP對(duì)刀豆蛋白致急性肝損傷小鼠肝臟組織中各通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比于ConA模型組，低、高劑量組小鼠肝臟組織中NF-κB、IKKα、p-IκBα、Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8、p-JNK、Bax、STAT3、p-STAT3、TLR4和TNFR1的表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2的水平顯著升高，但p-Akt的表達(dá)量并沒有顯著差異。由上述結(jié)果推測(cè)，AS

13、P可能通過以下途徑減輕刀豆蛋白誘導(dǎo)的急性肝損傷：
　　（1）減少氧化應(yīng)激及細(xì)胞因子的釋放，抑制 TNFR1和其配體結(jié)合及下游MAPK/JNK和Caspase家族信號(hào)通路，一方面阻礙JNK磷酸化及其誘導(dǎo)的Bax活化，減輕線粒體損傷；另一方面抑制 Caspase家族級(jí)聯(lián)信號(hào)通路激活，減少 Caspase-8活性片段的產(chǎn)生，減弱Bax的促凋亡作用。同時(shí)，Bax和Caspase-8水平的下降均可以下調(diào)Caspase-3的表達(dá)，阻礙肝細(xì)胞核

14、小體間的DNA裂解和細(xì)胞程序性死亡，從而抑制肝細(xì)胞的損傷及壞死。
　　（2）抑制TLR4和TNFR1的激活，減少IKKα亞基被磷酸化，從而下調(diào)IKK的表達(dá)。未活化的IKK不能使IκBα被磷酸化而停留在靜息狀態(tài)，與NF-κB p65/p50亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，阻礙NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核，從而降低炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，減少細(xì)胞因子的釋放以及肝臟細(xì)胞的凋亡壞死。
　?。?）抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路的過度激活

15、，降低STAT3的磷酸化水平，減少粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的大量分泌；同時(shí)減少肝細(xì)胞分泌急性期反應(yīng)蛋白，緩解肝細(xì)胞損傷壞死。
　　體外實(shí)驗(yàn)研究 ASP對(duì)刀豆蛋白誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞體外增殖作用及其對(duì) HepG2和HT29腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性作用的影響。將提取的脾總細(xì)胞用CFSE標(biāo)記后分孔刺激，即空白對(duì)照孔加入等體積1640完全培養(yǎng)基，ConA模型孔加入ConA（終濃度5μg/mL），ASP給藥孔加入ASP（終濃度25μg/mL）

16、和ConA（終濃度5μg/mL），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后加入混合的熒光標(biāo)記抗小鼠單抗（PE-Cy7 anti-CD3?、APC anti-CD4和PE anti-CD19），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖。增殖結(jié)果表明，ConA可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞和非CD4 T淋巴細(xì)胞的增殖，而對(duì)B淋巴細(xì)胞沒有明顯作用；ASP給藥孔CD4+T淋巴細(xì)胞和非CD4 T淋巴細(xì)胞的增值指數(shù)及百分增殖率均較ConA模型孔有顯著降低，而B淋巴細(xì)胞增殖現(xiàn)象明顯。采用

17、MTT實(shí)驗(yàn)考察在刀豆蛋白損害過程中ASP對(duì)細(xì)胞的直接保護(hù)作用。結(jié)果表明，相比于ConA模型孔，實(shí)驗(yàn)濃度的ASP（10、100和1000μg/mL）給藥后對(duì)HepG和HT29腫瘤細(xì)胞的增殖并沒有顯著變化，推測(cè)ASP并不是通過直接作用于被損害細(xì)胞而發(fā)揮肝保護(hù)作用。
　　第三部分當(dāng)歸多糖對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝保護(hù)作用機(jī)理研究
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用酒精誘導(dǎo)急性肝損傷模型：將小鼠隨機(jī)分組，低劑量給藥組小鼠每日單次尾靜脈注射 ASP1.5

18、 mg/kg；高劑量給藥組小鼠每日單次尾靜脈注射 ASP6 mg/kg；正常對(duì)照組及模型組小鼠每日單次尾靜脈注射等體積PBS。連續(xù)給藥14天，于第15天誘導(dǎo)損傷，即模型組及低、高劑量給藥組小鼠每次灌胃5 mL/kg50%酒精溶液，共灌胃三次，間隔1h；正常對(duì)照組小鼠每次灌胃等體積超純水，共灌胃三次，間隔1h。灌胃后禁食。造模6h后采集采用眶動(dòng)靜脈取血法收集血液。造模12h后稱量并記錄小鼠體重，處死小鼠后取出肝臟組織，均分并分別采用多聚甲

19、醛固定及-80℃冷凍處理。
　　通過觀察蘇木精-伊紅染色切片顯微圖片及計(jì)算各組小鼠肝指數(shù)和轉(zhuǎn)氨酶水平考察AS P對(duì)酒精致急性肝損傷的保護(hù)作用。由蘇木精-伊紅染色圖片可以觀察到，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)彌散出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞及細(xì)胞空洞；低劑量給藥組小鼠肝臟切片比模型組稍有好轉(zhuǎn)，而高劑量給藥組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)趨于完整，無明顯的細(xì)胞空洞，細(xì)胞核染色正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象消失。計(jì)算肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)，酒精造模后小鼠肝指數(shù)顯著上升，

20、而低、高劑量給藥組小鼠肝指數(shù)與模型組相比均明顯降低。由血清轉(zhuǎn)氨酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，低、高劑量給藥組小鼠血清AST及ALT水平較酒精模型組均有顯著下降，其 ALT平均水平甚至低于正常組小鼠。以上結(jié)果初步表明，ASP對(duì)酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷有良好的肝保護(hù)作用。
　　采用檢測(cè)試劑盒和雙抗體夾心 ELISA法探究 ASP對(duì)模型小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子（TNF-α，IFN-γ和IL-6）、內(nèi)毒素LPS及抗氧化相關(guān)指標(biāo)（SOD、CAT、GR、GSH-Px、

21、GSH、ROS和MDA）的影響。由結(jié)果可知，酒精模型組小鼠血清及肝臟組織中TNF-α和IFN-γ以及肝臟組織中IL-6水平顯著高于正常對(duì)照組，但血清IL-6水平?jīng)]有較明顯的改變；相比于模型組，低、高劑量給藥組小鼠血清及肝臟組織中TNF-α和IFN-γ明顯下降，高劑量給藥組肝臟組織中IL-6水平顯著低于模型組，但血清IL-6水平?jīng)]有較明顯的改變。酒精造模后，小鼠血清內(nèi)毒素水平較正常對(duì)照組顯著性增高，出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥；低、高劑量給藥組小鼠血清

22、內(nèi)毒素水平明顯低于模型組，內(nèi)毒素血癥得到緩解。低、高劑量組小鼠肝臟SOD、CAT、GR和GSH-Px等酶的活力及GSH水平相比酒精模型組顯著提高，而ROS和MDA的水平顯著下降。由上述結(jié)果推斷，預(yù)給藥AS P能夠有效地抑制酒精引起的機(jī)體免疫炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化能力，從而減輕酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷。
　　為進(jìn)一步探究 ASP對(duì)酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)及熒光顯微成像研究ASP對(duì)HepG2細(xì)胞中R

23、OS水平的影響；測(cè)定ASP對(duì)DPPH自由基的清除能力；試劑盒檢測(cè)小鼠血清及肝臟TG濃度；油紅O染色法觀察各組小鼠肝臟組織以及藥物干預(yù)后各孔HepG2細(xì)胞的油紅O染色顯微圖片。流式細(xì)胞術(shù)及顯微圖片結(jié)果表明，相比于模型組，各劑量給藥組 ASP顯著抑制酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS水平的升高。ASP對(duì)DPPH自由基的清除能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASP在1-20 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì) DPPH自由基具有良好的清除作用，而 ASP濃度為20 mg

24、/mL時(shí)，其清除率接近100%。TG檢測(cè)結(jié)果顯示，低、高劑量給藥組小鼠血清及肝臟TG濃度較模型組均有顯著性降低。油紅O染色顯微圖片可見，酒精模型組小鼠肝臟彌散大量橘紅色油脂，低劑量給藥組小鼠肝臟橘紅色脂滴數(shù)量比酒精模型組有所減少，而高劑量給藥組小鼠肝臟與正常對(duì)照組相似，油紅O切片中極少見到大片橘紅色油脂；酒精模型孔 HepG2細(xì)胞周圍彌散大量粘附的橘紅色油脂，各濃度實(shí)驗(yàn)孔橘紅色脂滴數(shù)量比酒精模型孔明顯減少，只有零星橘紅色油脂。由上述結(jié)果

25、推測(cè)，AS P能夠有效抑制酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕急性酒精性肝損傷。
　　體外實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為對(duì)象，采用MTT法研究ASP對(duì)酒精的直接細(xì)胞毒性的影響。由MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著酒精濃度的增加，酒精對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象越來越明顯，呈濃度依賴關(guān)系，且當(dāng)酒精濃度高于200 mM時(shí)，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率超過50%。與酒精對(duì)照組相比，各濃度的ASP可以較好地對(duì)抗酒精產(chǎn)生的抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且

26、當(dāng)ASP濃度大于50μg/mL時(shí)，其對(duì)各實(shí)驗(yàn)濃度酒精的細(xì)胞毒性均有較好的抑制作用，且呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系。由此可知，當(dāng)歸多糖對(duì)酒精的直接細(xì)胞毒性有良好的抑制效果，阻礙酒精介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　體外實(shí)驗(yàn)用藥物干預(yù)各孔 HepG2細(xì)胞后抽提細(xì)胞蛋白、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提取各組小鼠肝臟組織總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)生物樣本中各通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，低、高劑量組小鼠肝臟組織和酒精誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中Caspase-3、Bax、TLR4

27、和 CYP2E1的表達(dá)水平與酒精模型組相比均有顯著性降低，Bcl-2的表達(dá)水平顯著性增加。低、高劑量給藥組小鼠肝臟組織中NF-κB和p-IκBα的表達(dá)水平較模型組有顯著下降，但HepG2細(xì)胞中NF-κB和p-IκBα的表達(dá)水平與酒精模型孔沒有顯著性差異。由此分析，當(dāng)歸多糖可能通過以下途徑減輕酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷：
　　（1）減少Bax并增加Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2的比值，抑制酒精誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路；同時(shí)抑制

28、Caspase家族級(jí)聯(lián)信號(hào)通路激活，減少 Caspase-3的活化，阻斷肝細(xì)胞核小體間的DNA裂解和細(xì)胞程序性死亡，從而減輕肝細(xì)胞的損傷及壞死。
　　（2）通過調(diào)節(jié)TLR4的過度激活而抑制NF-κB信號(hào)通路，阻止IκBα被磷酸化而停留在靜息狀態(tài)，與NF-κB p65/p50亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，阻礙NF-κB解聚活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制NF-κB依賴的炎性細(xì)胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，減少細(xì)胞因子的釋放以及肝臟細(xì)胞的損傷壞死