當歸多糖肝靶向作用及保護急性肝損傷機理的研究.pdf

1、當歸，為傘形科多年生草本植物Angelica sinesis(Oliv.）Diels的干燥根，主要產(chǎn)地為我國甘肅岷縣。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，當歸作為補血活血及調(diào)經(jīng)止痛的要藥被廣泛使用。當歸多糖（Angelica Polysaccharide）是從當歸根中提取出的一種水溶性多糖，也是當歸的主要活性成分之一。近年來的研究表明，當歸多糖有著顯著的補血補鐵及促進機體免疫的作用，同時也對保護肝功能有著獨特的療效，但其作用機理尚不明確。
　　以當歸

2、的干燥根部為原料，采用水提醇沉法提取粗多糖，并經(jīng)純化得到精制當歸多糖ASP。通過化學及光譜圖譜對所得產(chǎn)物的純度和初級結(jié)構(gòu)進行分析。用熒光物質(zhì)標記ASP，考察其在大鼠肝臟組織的分布情況、不同濃度下的分子粒徑大小及對Toll樣受體和甘露糖受體的結(jié)合作用，探討AS P對肝臟的靶向作用。建立刀豆蛋白致肝損傷及酒精性肝損傷兩種急性肝損傷模型，通過體內(nèi)及體外實驗考察AS P對急性肝損傷的保護作用及機制，為增加ASP的臨床應(yīng)用范圍及藥效機制提供實驗和

3、理論基礎(chǔ)。
　　第一部分當歸多糖的肝靶向作用研究
　　采用傳統(tǒng)的水提醇沉法從當歸飲片中提取粗多糖，并通過反復(fù)凍融、微孔濾膜過濾法及Sephadex G-50色譜層析柱分離純化，得到白色絮狀固體ASP。紫外可見光光譜顯示ASP不含核酸和蛋白質(zhì)，由紅外光譜所示特征吸收峰推測ASP為β-D吡喃糖，苯酚-硫酸法測定其糖含量為90.25％，高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定其重均分子量（MW）為9.4×104 Da。
　　AS

4、P經(jīng)FITC標記后得橙黃色絮狀標記產(chǎn)物（FITC-ASP，F(xiàn)A）。FA產(chǎn)率穩(wěn)定，在紫外可見光及熒光掃描圖譜中可見典型的熒光素FITC的特征吸收峰，并且在PBS溶液及血漿中穩(wěn)定性較好，熒光標記取代度適宜，可成為研究當歸多糖肝靶向作用的工具。
　　體內(nèi)分布實驗采用四種濃度劑量（3、6、12及24 mg/kg）的FA經(jīng)尾靜脈注射SD大鼠，在給藥0.25、0.5、1、1.5、2、3和4 h時采用高效液相色譜儀檢測肝臟勻漿液的熒光強度。結(jié)果

5、顯示，給藥后FA迅速分布到肝臟組織并蓄積，至約1.5 h左右達到峰值。隨后，肝臟組織中FA的濃度逐漸下降，至4 h后基本從肝臟組織中清除。
　　原子力顯微鏡和布魯克海文粒度儀實驗結(jié)果表明，ASP的濃度為1μg/mL至20 mg/mL時，ASP在溶液中分散均勻，穩(wěn)定性較好，其粒徑在200 nm到3μm之間，在肝臟的被動靶向粒徑范圍內(nèi)，可被肝巨噬細胞（Kupffer細胞）攝取而聚集于肝臟組織，產(chǎn)生被動靶向肝臟的作用。
　　Kup

6、ffer細胞TLR4及甘露糖受體的體外拮抗實驗證實，Kupffer細胞可以通過甘露糖受體與當歸多糖ASP產(chǎn)生特異性結(jié)合作用，而Kupffer細胞上的TLR4與ASP并沒有明顯的結(jié)合作用。上述結(jié)果表明，AS P可通過與甘露糖受體結(jié)合產(chǎn)生部分主動肝靶向作用，為后續(xù)當歸多糖對急性肝損傷保護作用的研究提供實驗思路及理論基礎(chǔ)。
　　第二部分當歸多糖對刀豆蛋白致急性肝損傷小鼠肝保護作用機理研究
　　體內(nèi)實驗采用刀豆蛋白誘導(dǎo)急性肝損傷模型

7、：將小鼠隨機分組，低劑量給藥組小鼠每日單次尾靜脈注射ASP1.5 mg/kg；高劑量給藥組及ASP毒性試驗組小鼠每日單次尾靜脈注射 ASP6 mg/kg；正常對照組及模型組小鼠每日單次尾靜脈注射等體積PBS。連續(xù)給藥14天，于第15天誘導(dǎo)損傷，即模型組及低、高劑量給藥組小鼠單次尾靜脈注射ConA15 mg/kg；正常對照組及ASP毒性試驗小鼠單次尾靜脈注射等體積0.01 M PBS。造模8 h后采用眶動靜脈取血法采集血液。造模20 h后

8、稱量并記錄小鼠體重，處死小鼠后取出肝臟組織，均分并分別采用多聚甲醛固定及-80℃冷凍處理。
　　通過觀察肝臟表觀形態(tài)、蘇木精-伊紅染色切片顯微圖片及計算各組小鼠肝指數(shù)和轉(zhuǎn)氨酶水平考察 ASP對刀豆蛋白致急性肝損傷的保護作用。觀察肝臟表觀形態(tài)可見，造模后小鼠肝臟顏色發(fā)黑變暗，有嚴重的血液淤積現(xiàn)象；低、高劑量給藥組小鼠肝臟顏色較模型組均有所恢復(fù)。由蘇木精-伊紅染色圖片可以觀察到，ConA致急性肝損傷模型建立后，小鼠肝臟組織出現(xiàn)大面積壞

9、死、細胞核固縮、細胞破碎，匯管區(qū)及肝實質(zhì)內(nèi)有嚴重的炎性細胞浸潤；相比于模型組，低、高劑量給藥組小鼠肝臟細胞形態(tài)趨于完整，無明顯的壞死區(qū)域，匯管區(qū)和肝實質(zhì)內(nèi)炎性細胞數(shù)量明顯減少。計算肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，ConA模型組小鼠肝指數(shù)從4.32%上升為6.08%，而經(jīng)ASP預(yù)給藥的兩組小鼠肝指數(shù)較ConA模型組均明顯降低。血清轉(zhuǎn)氨酶檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ConA模型組小鼠血清AST及ALT較正常對照組小鼠顯著上升了近千倍，而低、高劑量給藥組小鼠

10、血清AST及ALT水平較ConA模型組均有極顯著降低。以上結(jié)果表明，AS P對刀豆蛋白致急性肝損傷有良好的肝保護作用。AS P毒性試驗組小鼠各指標與正常對照組相比并沒有顯著改變，證實在實驗設(shè)計的劑量濃度下ASP對小鼠無毒副作用。
　　采用檢測試劑盒和雙抗體夾心 ELISA法探究 ASP對模型小鼠血清細胞因子（TNF-α，IFN-γ，IL-2和IL-6）及抗氧化相關(guān)指標（SOD、ROS和MDA）的影響。由結(jié)果可知，ConA模型組小鼠

11、血清免疫相關(guān)細胞因子 TNF-α，IFN-γ，IL-2和 IL-6與正常對照組相比顯著升高，體內(nèi)ROS及MDA水平均異常增加，而SOD酶活力明顯降低；與ConA模型組相比，低、高劑量組小鼠TNF-α，IFN-γ，IL-2和IL-6水平均有顯著降低，體內(nèi)ROS及MDA水平明顯下降，而SOD酶活力顯著增加。上述結(jié)果顯示，預(yù)給藥AS P能夠有效地抑制刀豆蛋白引起的機體免疫炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化能力，從而減輕刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝損傷。

12、>　　采用蛋白質(zhì)印跡法檢測 ASP對刀豆蛋白致急性肝損傷小鼠肝臟組織中各通路關(guān)鍵蛋白表達的影響。實驗結(jié)果顯示，相比于ConA模型組，低、高劑量組小鼠肝臟組織中NF-κB、IKKα、p-IκBα、Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8、p-JNK、Bax、STAT3、p-STAT3、TLR4和TNFR1的表達水平明顯降低，Bcl-2的水平顯著升高，但p-Akt的表達量并沒有顯著差異。由上述結(jié)果推測，AS

13、P可能通過以下途徑減輕刀豆蛋白誘導(dǎo)的急性肝損傷：
　?。?）減少氧化應(yīng)激及細胞因子的釋放，抑制 TNFR1和其配體結(jié)合及下游MAPK/JNK和Caspase家族信號通路，一方面阻礙JNK磷酸化及其誘導(dǎo)的Bax活化，減輕線粒體損傷；另一方面抑制 Caspase家族級聯(lián)信號通路激活，減少 Caspase-8活性片段的產(chǎn)生，減弱Bax的促凋亡作用。同時，Bax和Caspase-8水平的下降均可以下調(diào)Caspase-3的表達，阻礙肝細胞核

14、小體間的DNA裂解和細胞程序性死亡，從而抑制肝細胞的損傷及壞死。
　?。?）抑制TLR4和TNFR1的激活，減少IKKα亞基被磷酸化，從而下調(diào)IKK的表達。未活化的IKK不能使IκBα被磷酸化而停留在靜息狀態(tài)，與NF-κB p65/p50亞單位以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，阻礙NF-κB活化進入細胞核，從而降低炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，減少細胞因子的釋放以及肝臟細胞的凋亡壞死。
　?。?）抑制IL-6/STAT3信號通路的過度激活

15、，降低STAT3的磷酸化水平，減少粒細胞和淋巴細胞增殖及細胞因子的大量分泌；同時減少肝細胞分泌急性期反應(yīng)蛋白，緩解肝細胞損傷壞死。
　　體外實驗研究 ASP對刀豆蛋白誘導(dǎo)的淋巴細胞體外增殖作用及其對 HepG2和HT29腫瘤細胞的直接細胞毒性作用的影響。將提取的脾總細胞用CFSE標記后分孔刺激，即空白對照孔加入等體積1640完全培養(yǎng)基，ConA模型孔加入ConA（終濃度5μg/mL），ASP給藥孔加入ASP（終濃度25μg/mL）

16、和ConA（終濃度5μg/mL），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后加入混合的熒光標記抗小鼠單抗（PE-Cy7 anti-CD3?、APC anti-CD4和PE anti-CD19），用流式細胞儀檢測細胞增殖。增殖結(jié)果表明，ConA可促進CD4+T淋巴細胞和非CD4 T淋巴細胞的增殖，而對B淋巴細胞沒有明顯作用；ASP給藥孔CD4+T淋巴細胞和非CD4 T淋巴細胞的增值指數(shù)及百分增殖率均較ConA模型孔有顯著降低，而B淋巴細胞增殖現(xiàn)象明顯。采用

17、MTT實驗考察在刀豆蛋白損害過程中ASP對細胞的直接保護作用。結(jié)果表明，相比于ConA模型孔，實驗濃度的ASP（10、100和1000μg/mL）給藥后對HepG和HT29腫瘤細胞的增殖并沒有顯著變化，推測ASP并不是通過直接作用于被損害細胞而發(fā)揮肝保護作用。
　　第三部分當歸多糖對急性酒精性肝損傷小鼠肝保護作用機理研究
　　體內(nèi)實驗采用酒精誘導(dǎo)急性肝損傷模型：將小鼠隨機分組，低劑量給藥組小鼠每日單次尾靜脈注射 ASP1.5

18、 mg/kg；高劑量給藥組小鼠每日單次尾靜脈注射 ASP6 mg/kg；正常對照組及模型組小鼠每日單次尾靜脈注射等體積PBS。連續(xù)給藥14天，于第15天誘導(dǎo)損傷，即模型組及低、高劑量給藥組小鼠每次灌胃5 mL/kg50%酒精溶液，共灌胃三次，間隔1h；正常對照組小鼠每次灌胃等體積超純水，共灌胃三次，間隔1h。灌胃后禁食。造模6h后采集采用眶動靜脈取血法收集血液。造模12h后稱量并記錄小鼠體重，處死小鼠后取出肝臟組織，均分并分別采用多聚甲

19、醛固定及-80℃冷凍處理。
　　通過觀察蘇木精-伊紅染色切片顯微圖片及計算各組小鼠肝指數(shù)和轉(zhuǎn)氨酶水平考察AS P對酒精致急性肝損傷的保護作用。由蘇木精-伊紅染色圖片可以觀察到，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠肝臟實質(zhì)內(nèi)彌散出現(xiàn)大量炎性細胞及細胞空洞；低劑量給藥組小鼠肝臟切片比模型組稍有好轉(zhuǎn)，而高劑量給藥組小鼠肝臟細胞形態(tài)趨于完整，無明顯的細胞空洞，細胞核染色正常，炎性細胞浸潤現(xiàn)象消失。計算肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)，酒精造模后小鼠肝指數(shù)顯著上升，

20、而低、高劑量給藥組小鼠肝指數(shù)與模型組相比均明顯降低。由血清轉(zhuǎn)氨酶實驗結(jié)果可知，低、高劑量給藥組小鼠血清AST及ALT水平較酒精模型組均有顯著下降，其 ALT平均水平甚至低于正常組小鼠。以上結(jié)果初步表明，ASP對酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷有良好的肝保護作用。
　　采用檢測試劑盒和雙抗體夾心 ELISA法探究 ASP對模型小鼠體內(nèi)細胞因子（TNF-α，IFN-γ和IL-6）、內(nèi)毒素LPS及抗氧化相關(guān)指標（SOD、CAT、GR、GSH-Px、

21、GSH、ROS和MDA）的影響。由結(jié)果可知，酒精模型組小鼠血清及肝臟組織中TNF-α和IFN-γ以及肝臟組織中IL-6水平顯著高于正常對照組，但血清IL-6水平?jīng)]有較明顯的改變；相比于模型組，低、高劑量給藥組小鼠血清及肝臟組織中TNF-α和IFN-γ明顯下降，高劑量給藥組肝臟組織中IL-6水平顯著低于模型組，但血清IL-6水平?jīng)]有較明顯的改變。酒精造模后，小鼠血清內(nèi)毒素水平較正常對照組顯著性增高，出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥；低、高劑量給藥組小鼠血清

22、內(nèi)毒素水平明顯低于模型組，內(nèi)毒素血癥得到緩解。低、高劑量組小鼠肝臟SOD、CAT、GR和GSH-Px等酶的活力及GSH水平相比酒精模型組顯著提高，而ROS和MDA的水平顯著下降。由上述結(jié)果推斷，預(yù)給藥AS P能夠有效地抑制酒精引起的機體免疫炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化能力，從而減輕酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷。
　　為進一步探究 ASP對酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響，采用流式細胞術(shù)及熒光顯微成像研究ASP對HepG2細胞中R

23、OS水平的影響；測定ASP對DPPH自由基的清除能力；試劑盒檢測小鼠血清及肝臟TG濃度；油紅O染色法觀察各組小鼠肝臟組織以及藥物干預(yù)后各孔HepG2細胞的油紅O染色顯微圖片。流式細胞術(shù)及顯微圖片結(jié)果表明，相比于模型組，各劑量給藥組 ASP顯著抑制酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞ROS水平的升高。ASP對DPPH自由基的清除能力的實驗結(jié)果顯示，ASP在1-20 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對 DPPH自由基具有良好的清除作用，而 ASP濃度為20 mg

24、/mL時，其清除率接近100%。TG檢測結(jié)果顯示，低、高劑量給藥組小鼠血清及肝臟TG濃度較模型組均有顯著性降低。油紅O染色顯微圖片可見，酒精模型組小鼠肝臟彌散大量橘紅色油脂，低劑量給藥組小鼠肝臟橘紅色脂滴數(shù)量比酒精模型組有所減少，而高劑量給藥組小鼠肝臟與正常對照組相似，油紅O切片中極少見到大片橘紅色油脂；酒精模型孔 HepG2細胞周圍彌散大量粘附的橘紅色油脂，各濃度實驗孔橘紅色脂滴數(shù)量比酒精模型孔明顯減少，只有零星橘紅色油脂。由上述結(jié)果

25、推測，AS P能夠有效抑制酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕急性酒精性肝損傷。
　　體外實驗以HepG2細胞為對象，采用MTT法研究ASP對酒精的直接細胞毒性的影響。由MTT實驗結(jié)果可知，隨著酒精濃度的增加，酒精對HepG2細胞的生長抑制現(xiàn)象越來越明顯，呈濃度依賴關(guān)系，且當酒精濃度高于200 mM時，HepG2細胞的生長抑制率超過50%。與酒精對照組相比，各濃度的ASP可以較好地對抗酒精產(chǎn)生的抑制HepG2細胞生長的作用，且

26、當ASP濃度大于50μg/mL時，其對各實驗濃度酒精的細胞毒性均有較好的抑制作用，且呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系。由此可知，當歸多糖對酒精的直接細胞毒性有良好的抑制效果，阻礙酒精介導(dǎo)的細胞死亡。
　　體外實驗用藥物干預(yù)各孔 HepG2細胞后抽提細胞蛋白、體內(nèi)實驗提取各組小鼠肝臟組織總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測生物樣本中各通路關(guān)鍵蛋白的表達。結(jié)果顯示，低、高劑量組小鼠肝臟組織和酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞中Caspase-3、Bax、TLR4

27、和 CYP2E1的表達水平與酒精模型組相比均有顯著性降低，Bcl-2的表達水平顯著性增加。低、高劑量給藥組小鼠肝臟組織中NF-κB和p-IκBα的表達水平較模型組有顯著下降，但HepG2細胞中NF-κB和p-IκBα的表達水平與酒精模型孔沒有顯著性差異。由此分析，當歸多糖可能通過以下途徑減輕酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷：
　　（1）減少Bax并增加Bcl-2的表達，下調(diào)Bax/Bcl-2的比值，抑制酒精誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號通路；同時抑制

28、Caspase家族級聯(lián)信號通路激活，減少 Caspase-3的活化，阻斷肝細胞核小體間的DNA裂解和細胞程序性死亡，從而減輕肝細胞的損傷及壞死。
　?。?）通過調(diào)節(jié)TLR4的過度激活而抑制NF-κB信號通路，阻止IκBα被磷酸化而停留在靜息狀態(tài)，與NF-κB p65/p50亞單位以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，阻礙NF-κB解聚活化后進入細胞核內(nèi)，從而抑制NF-κB依賴的炎性細胞因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，減少細胞因子的釋放以及肝臟細胞的損傷壞死