當(dāng)歸多糖ASP1體內(nèi)外特異性肝靶向研究.pdf

1、當(dāng)歸多糖是中藥當(dāng)歸的主要生物活性成分,在抗貧血、抗腫瘤、肝損傷、免疫作用等方面具有顯著活性。本實(shí)驗(yàn)以岷縣當(dāng)歸飲片為原料,采用水提、酸堿除蛋白的方法提取當(dāng)歸飲片中的當(dāng)歸總多糖,再經(jīng)醇沉、超濾分級分離和葡聚糖凝膠G50分離純化得到精制當(dāng)歸多糖組分,命名為ASP1;當(dāng)歸多糖ASP1經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記,成為可發(fā)射熒光的物質(zhì),在此基礎(chǔ)上對當(dāng)歸多糖ASP1體內(nèi)外特異性肝靶向作用進(jìn)行研究。
　　第一部分，當(dāng)歸多糖ASP1的提取、分

2、離和純化
　　以岷縣當(dāng)歸飲片為原料,采用水提、酸堿除蛋白的方法提取當(dāng)歸飲片中的當(dāng)歸總多糖,經(jīng)醇沉、超濾分級分離除掉小分子色素和寡糖等雜質(zhì),再經(jīng)葡聚糖凝膠G50進(jìn)一步分離純化得到精制當(dāng)歸多糖組分,命名為ASP1。通過測定ASP1糖含量、相對分子質(zhì)量,以及進(jìn)行碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)和紫外掃描鑒定純度。經(jīng)苯酚-硫酸法測得ASP1糖含量為90.8％,高效凝膠色譜法測得其相對分子質(zhì)量為8.780×104Da,碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)及紫外掃描圖譜顯示ASP1

3、不含淀粉、蛋白質(zhì)和核酸。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)制備得到分子量均一、純度高的當(dāng)歸多糖ASP1組分。
　　第二部分，當(dāng)歸多糖ASP1的熒光標(biāo)記、產(chǎn)物分析及生物樣品中的穩(wěn)定性考察
　　當(dāng)歸多糖ASP1進(jìn)行FITC熒光標(biāo)記,標(biāo)記產(chǎn)率為83%。采用紫外可見光譜法、熒光光譜法和高效凝膠滲透色譜法考察ASP1熒光標(biāo)記效率。紫外可見光譜分析結(jié)果顯示,ASP1標(biāo)記產(chǎn)物在494nm附近出現(xiàn)特征吸收峰,而未標(biāo)記的ASP1不具有此特征吸收峰,紫外可見分光

4、光度法測定其FITC的取代度為1.18%(w/w)。熒光光譜分析結(jié)果顯示,ASP1標(biāo)記產(chǎn)物有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,其λex=494nm,λem=520nm。經(jīng)高效凝膠滲透色譜分析,ASP1標(biāo)記產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為8.870×104Da,標(biāo)記前后ASP1分子量未發(fā)生明顯變化,表明熒光標(biāo)記對ASP1結(jié)構(gòu)影響較小。本實(shí)驗(yàn)采用高效凝膠滲透色譜熒光檢測法測定ASP1標(biāo)記產(chǎn)物加入生物樣品前后的分子量和熒光強(qiáng)度,考察ASP1標(biāo)記產(chǎn)物在0.01MPBS溶液、

5、體外血漿樣品和體內(nèi)血漿樣品中的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,在0.01MPBS溶液和體外血漿樣品中,ASP1標(biāo)記產(chǎn)物的分子量和熒光強(qiáng)度于避光37℃,60rpm孵育條件下20h內(nèi)均未發(fā)生明顯改變;大鼠尾靜脈給藥2h后取血樣測定標(biāo)記產(chǎn)物分子量,其分子量未發(fā)生改變,表明ASP1在生物樣品中的穩(wěn)定性良好。本實(shí)驗(yàn)制備的ASP1標(biāo)記產(chǎn)物產(chǎn)率高、取代度適宜、熒光強(qiáng)度較高、穩(wěn)定性良好,適用于后續(xù)當(dāng)歸多糖ASP1體內(nèi)外特異性肝靶向研究。
　　第三部分，當(dāng)歸多糖

6、ASP1的體內(nèi)肝靶向性研究
　　1.生物樣品中ASP1含量測定方法的建立
　　利用ASP1標(biāo)記產(chǎn)物可發(fā)射熒光的性質(zhì),本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜熒光檢測法測定生物樣品中ASP1含量的方法。該方法經(jīng)方法學(xué)確證,ASP1在各生物樣品中的定量下限為0.20μg/mL,在0.25~20.00μg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系,r2﹥0.999。測定0.5μg/mL、2.5μg/mL和25.0μg/mL三種不同濃度下樣品的回收率

7、和精密度,測得回收率在91.98%~114.20%之間,精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差符合要求。樣品在4℃避光條件下放置3天、-20℃避光條件下放置7天穩(wěn)定性良好。該方法樣品用量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密度和重現(xiàn)性較好,適用于藥代動力學(xué)和組織分布實(shí)驗(yàn)大量樣本的檢測。該方法的建立為研究當(dāng)歸多糖ASP1在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和組織分布奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。
　　2.ASP1在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和組織分布研究
　　測定12mg/kg劑量的AS

8、P1經(jīng)尾靜脈給藥后在SD大鼠體內(nèi)的藥物濃度-時間數(shù)據(jù),采用DAS2.1.1版軟件擬合房室模型并計算出藥動學(xué)參數(shù),得出ASP1在大鼠體內(nèi)的最佳模型為兩室模型,ASP1的t1/2=15.931min,CL=0.001L/min/kg,MRT(0-∞)=23.536min。參考ASP1的藥時曲線和藥代動力學(xué)參數(shù),確定ASP1尾靜脈給藥后在大鼠體內(nèi)的組織分布取樣時間點(diǎn)為30min、60min和120min。組織分布結(jié)果顯示,給藥后除肝臟中ASP

9、1濃度大幅升高外,其它組織中ASP1濃度均較低。給藥120min后,血液中ASP1濃度降至Cmax的1/60以下,此時ASP1在血液和各組織中濃度由高到低依次為肝?血液>腸>心>脾>肺>胃>腎>腦,肝臟中ASP1的濃度高出其它組織中濃度的30倍以上,充分說明ASP1具有很強(qiáng)的特異性肝靶向作用。本課題組研究結(jié)果表明當(dāng)歸多糖ASP1的粒徑范圍為0.6~1.2μm,在肝和脾的被動靶向粒徑范圍內(nèi)。給藥后,ASP1濃集于肝臟而在脾臟中的濃度很低,

10、且多數(shù)研究表明肝臟和脾臟對于同一藥物的被動靶向作用較為相近,由此可初步推斷ASP1對肝的被動靶向作用較弱,主動靶向作用占主導(dǎo)地位。
　　3.ASP1體內(nèi)肝靶向的肝組織切片觀察
　　大鼠尾靜脈注射120mg/kg劑量的ASP1作為實(shí)驗(yàn)組,注射生理鹽水作為陰性對照組,120min后處死大鼠并制備肝臟組織切片,激光共聚焦顯微觀察結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組肝臟切片的熒光強(qiáng)度明顯高于陰性對照組,且實(shí)驗(yàn)組肝臟切片中大部分ASP1進(jìn)入到肝細(xì)胞胞漿,

11、細(xì)胞間質(zhì)分布較少,表明ASP1經(jīng)肝細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),由此進(jìn)一步證實(shí)了ASP1具有很好的主動肝靶向作用。
　　第四部分，當(dāng)歸多糖ASP1的體外肝靶向性研究
　　采用原位膠原酶灌流法提取大鼠原代肝細(xì)胞,構(gòu)建當(dāng)歸多糖ASP1體外特異性肝靶向研究模型。該方法提取得到的肝細(xì)胞活力高于90%,其中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞所占比例較大。向大鼠原代肝細(xì)胞(1×106)中分別加入50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL濃度梯度的ASP1標(biāo)記產(chǎn)物

12、作為實(shí)驗(yàn)組,加入空白培養(yǎng)基作為陰性對照組,共培養(yǎng)2h后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組原代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在加入ASP1標(biāo)記產(chǎn)物后發(fā)生顯著改變(與陰性對照組相比,*p﹤0.05),且細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨ASP1濃度遞增而加強(qiáng)。與陰性對照組相比,實(shí)驗(yàn)組原代肝細(xì)胞中熒光強(qiáng)度增加的細(xì)胞數(shù)目占總體細(xì)胞數(shù)目的比例(即靶向率)隨著ASP1濃度遞增而加大,50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL劑量組的靶向率分別為73.93%、94.83%和9