甘草次酸對急性肝損傷的保護作用及分子機制研究.pdf

1、第一部分甘草次酸對對乙酰氨基酚致肝損傷的保護作用及機制研究
　　目的:研究甘草次酸(GA)對對乙酰氨基酚（APAP）致肝損傷的保護作用，并進一步探討其分子機制。
　　方法: Balb/c小鼠在APAP腹腔注射前30 min，給予GA(100mg/kg)預(yù)處理，并進行血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織學(xué)分析和谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定。分別應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl trans

2、ferase mediated nick end labeling,TUNEL)分析肝細胞凋亡情況，免疫組織熒光或化學(xué)檢測激活型caspase-3、高遷移率族蛋白1（high mobility group box1，HMGB1）和F4/80表達水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白細胞介素

3、(interleukin，IL)-1β水平，western blot檢測細胞色素酶P450(cytochrome enzyme P450,CYP)2E1、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)4、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、p-IκB和白細胞介素1受體相關(guān)激酶M(interleukin-1receptor-associated kin

4、ase-M，IRAK-M)和蛋白表達水平，定量PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, QRT-PCR)檢測CYP2E1 mRNA表達水平，流式細胞學(xué)檢測分析肝臟內(nèi)中性粒細胞募集情況。
　　結(jié)果:GA預(yù)處理對APAP致肝損傷具有保護作用，包括降低ALT/AST活性、減輕肝臟病理損傷程度和肝細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)GA可通過降低CYP2E1的蛋

5、白和mRNA表達水平抑制APAP代謝，并增高肝臟GSH水平。不僅如此，GA對APAP刺激誘導(dǎo)的HMGB1增多，p38-MAPK和IκB信號激活以及TNF-α和IL-1β產(chǎn)生具有抑制作用，但我們發(fā)現(xiàn)TLR4表達并未受到影響，而IRAK-M的蛋白表達上調(diào)。進一步實驗表明，GA可減少肝臟內(nèi)中性粒細胞募集和巨噬細胞浸潤。
　　結(jié)論:結(jié)果表明，GA對APAP誘導(dǎo)的肝損傷具有保護作用。一方面，GA可下調(diào)CYP2E1表達調(diào)節(jié)APAP代謝，增高G

6、SH水平。另一方面，GA可以減少HMGB1釋放和肝臟內(nèi)中性粒細胞募集及巨噬細胞浸潤，抑制TLR4介導(dǎo)的信號通路，減少炎癥細胞因子的產(chǎn)生，從而減輕肝臟在無菌性炎癥發(fā)生是所承受的二次損傷。但GA并未影響TLR4的表達，其潛在的分子機制可能與IRAK-M表達上調(diào)有關(guān)。
　　第二部分甘草次酸對脂多糖誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭的保護作用及機制研究
　　目的:研究甘草次酸(GA)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭（FHF）的保護作用，并進一步

7、探討其分子機制。
　　方法: Balb/c小鼠在LPS/D-半乳糖胺(D-GalN)腹腔注射前30min，接受GA(10，30，100 mg/kg)預(yù)處理，并進行死亡率、肝組織學(xué)、血清轉(zhuǎn)氨酶測定。并分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)檢測肝臟和血清腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)水平。定量PCR(quantitativ

8、e reversetranscription-polymerase chain reaction， QRT-PCR)檢測肝臟TNF-α mRNA表達。western blot檢測Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)4、白細胞介素1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associatedkinases，IRAKs）1，p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated prote

9、inkinases，MAPKs)、IκB和IRAK-M的蛋白表達。免疫共沉淀法測定IRAK-1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factorreceptor-associated factor, TRAF)的結(jié)合活性。此外，小鼠巨噬細胞系RAW264.7在LPS刺激前，經(jīng)GA(10-5M)預(yù)處理。分別應(yīng)用流式細胞學(xué)檢測Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)4/髓樣分化因子2(myeloi

10、ddifferentiation factor2，MD2)的表達。熒光素酶報告基因檢測AP-1和NF-κB的活性。western blot檢測IRAK-M的蛋白表達。ELISA檢測上清TNF-α水平。腺病毒IRAK-M siRNA轉(zhuǎn)染干擾巨噬細胞IRAK-M表達。
　　結(jié)果:GA預(yù)處理對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的FHF具有保護作用，包括劑量依賴性降低死亡率、ALT/AST活性以及減輕肝臟病理損傷程度。同時，GA可降低LPS/D-G

11、alN誘導(dǎo)的血清和肝組織中TNF-α表達并抑制p38 MAPK和IκB激活。不僅如此，GA不影響TLR4的表達，可抑制IRAK-1和TRAF的結(jié)合活性，并上調(diào)IRAK-M表達。此外，GA處理的巨噬細胞對LPS刺激誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生和AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用，但并未影響到TLR4/MD2水平同時上調(diào)IRAK-M的表達。使用IRAK-M的siRNA沉默巨噬細胞內(nèi)IRAK-M表達后，GA的保護作用被抑制。
　　結(jié)論:結(jié)果